第三章生物大分子的分离纯化_new祥解.ppt

一、防止RNase对RNA 的水解 一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性。 二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。 对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。 创造一个无RNase的环境 RNase分布广泛，包括细胞内，环境、试剂、器皿、人体的汗液、唾液 RNase异常稳定，耐热、酸、碱，蛋白质变性剂仅能使其暂时失活，去除变性剂又恢复活性 RNase不需要辅助因子，EDTA对其活性无影响。 防止RNase对RNA 的水解 RNase的来源 样品 试剂 多次使用的器具 裸露的手 说话产生的唾沫 空气 RNase非常稳定，它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。 RNase是导致RNA降解的最主要物质！ 去除外源性RNase污染 玻璃器皿处理： 量筒、试剂瓶等玻璃器皿须260℃烘烤2小时以上。 塑料器皿处理： 0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌。 试剂处理： 氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后RNA专用。专用的RNA操作室、专用器械。 操作时戴口罩、手套、帽子、穿实验服。 避免内源RNase污染 细胞破裂的同时，RNase释放出来，这种内源性的RNase是降解RNA的主要危险之一； 原则上要尽可能早地去除细胞内的蛋白质，加入RNA酶抑制剂。 不同组织细胞的RNase含量不等，胰、脾中最丰富。 RNase 变性剂（联合使用） RNase阻抑蛋白（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白质，是RNase的非竞争性抑制剂。 DEPC（二乙基焦碳酸盐）：很强的核酸酶变性剂，与肝素联合使用具有极强的RNase抑制效果。 酚、氯仿不但能使核蛋白质与核酸解聚而且可以利用其对蛋白质的变性作用抑制RNase的活力。 解偶剂（胍类）：盐酸胍、异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速于核酸分离，故又称解偶剂。 在变性剂中加入β-巯基乙醇，DTT等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。 二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离总RNA 1、原理： 用含异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的强变性溶液裂解细胞，使RNA与蛋白质分离并进入溶液； RNase被异硫氰酸胍、β-巯基乙醇变性灭活； 在PH4.0的条件下抽提细胞裂解溶液，在酸性条件下，DNA是不溶性的，而RNA是可溶性的，DNA会随蛋白质一起除去，而RNA仍留在水相中； 最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。 匀浆组织 4℃/细胞裂解液（异硫氰酸胍、巯基乙醇、SDS等） 苯酚/氯仿抽提 乙醇沉淀 重新溶解RNA (DEPC水) 提取流程 取上层水相 离心 三、总RNA分离试剂盒（TRIzol） TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。 TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用 。 TRIzol进口品牌当仁不让地选择Invitrogen公司，该公司的TRIzol市场占有率是最高的。现在国内也开发出很多同类产品，如天根公司的TRNzol，Vazyme生物的Isolater，广州捷倍斯的TRNsol等。 真核细胞总RNA提取——实验步骤 收集细胞 上层溶液 离心洗涤 裂解变性 异丙醇沉淀 抽 提 RNA溶液 干燥溶解 详细实验步骤请参考说明书！ RNA电泳（完整性检测） 基本过程同DNA电泳一样 必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNase对样品的降解。 RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 四、RNA提取常见问题 RNA降解 DNA残留 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 RNA提取常见问题分析 RNA降解 外源RNase的污染 裂解液质量 裂解液用量不足 样品本身富含RNase 环境温度过高 28S 18S 5S RNA提取常见问题分析 DNA残留 样本量过多 吸取到中间层及下层试剂 解决办法： DNA酶（RNase free）消化，再抽提纯化处理。 R