物理图谱与测序课件.ppt

第三章DNA物理图谱的构建及序列测定 物理图谱（physical map） 物理图/限制性图谱（restriction map）是各种限制性内切酶切点在某一DNA分子或DNA片段上的排列，由于各酶切点之间的距离是以碱基对（kbp → mbp）表示的，所以可计算出二切点间的绝对距离，因此限制图也称物理图。物理图谱的构建是基因组研究的重要组成部分。 一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 细菌核酸内切酶 识别、剪切特殊双链DNA序列 用途：DNA物理图谱构建、DNA序列分析、基因分离、基因定位、DNA重组 1.细菌的 修饰作用和限制性核酸内切酶的发现 20世纪50年代，Luria Human、Bertani Weigle： 噬菌体 →细菌菌株1，正常生长。 →细菌菌株2，生长受到强烈抑制；少数存 活，再次感染菌株2，正常生长——受到 宿主的特意修饰。机制？ 1962，Arber：宿主的修饰在噬菌体DNA上进行 1965，Arber：宿主对入侵噬菌体的修饰与噬菌体DNA降解密切相关；预言细菌中存在位点特异性限制酶；修饰是宿主甲基化酶作用结果：建立细菌限制-修饰（R-M）系统概念。 Arber假说 细菌中存在具有相同位点特异性的 2种酶 ：限制性内切核酸酶；甲基化酶 细菌的限制-修饰系统是抵御外来侵袭的一种重要措施 1978年诺贝尔生理学或医学奖 限制性核酸内切酶的发现 1968年，Linn Arber于大肠杆菌B中发现第一种限制性内切核酸酶（I型：识别特异剪切随机）。 1968年，Meselson Yuan从大肠杆菌K中获得高纯度限制性内切核酸酶（I型）。 1970年，Smith从流感嗜血杆菌Rd中分离出第一种II型限制性内切核酸酶——Hind II。 流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，→ HindⅡ 限制性内切酶。 HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下： ????????????5 … GTPy ↓ PuAC … 3 ????????????3 … CAPu ↑ PyTG … 5  上世纪80年代，限制性内切酶开始克隆表达 限制-修饰系统 Smith等的工作 流感嗜血杆菌Rd与其它细菌相似DNA碱基化程度低： m5C，N6-mA；但存在甲基化酶 细胞粗提物→磷酸纤维素层析→蛋白； * S-腺苷甲硫氨酸转移甲基→鱼精DNA/T7DNA。——检测出4种腺嘌呤甲基化酶 其中一种处理T7DNA →免受Hind II裂解；先用Hind II处理鱼精DNA →对应甲基化位点破坏。——限制性内切酶-修饰性甲基化酶共识别位点 限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用。 磷酸纤维素层析——阳离子交换层析 离子交换层析分离蛋白质 S-腺苷甲硫氨酸 SAM为体内甲基的直接供体 腺苷或胞嘧啶的甲基化是多种细菌的限制修饰系统的一部份 真核生物中也存在广泛的DNA甲基化修饰现象 哺乳动物DNA的甲基化修饰和X染色体失活、胚胎发育、组织分化乃至癌症密切相关。 真核生物，修饰则影响基因表达。大多数情况下，甲基化修饰导致基因表达沉默。并且这种修饰在细胞有丝分裂时可以代代传递 新的遗传学分枝--表观遗传学 2. 限制性内切酶的种类与特性 限制性内切酶形式多样 大小：Pvu II（157个氨基酸）； Cje I （1250个氨基酸）。 纯化分类的3000余种限制性内切酶，超过250种特异识别序列。 研发工作仍在继续：分析细胞提取物，计算机分析已知基因组数据。 同裂酶（识别序列与已有的重复）；新识别位点 传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。 I型限制性内切酶 兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体(3x105-4x105Da)，需Mg2+、ATP、SAM。 在识别位点很远的地方任意切割DNA链：EcoB 识别位点——TGA*（N）8TGCT ；EcoK 识别位点——AA°C（N）6GTGC （ A 为可能的甲基化位点， N 表示任意碱基） 。切割位点在识别位点 1000bp 以外，且无特异性。 不产生确定的限制片段，不具备实用性。 II型限制性内切酶 种类多（2x104-10x104），需Mg2