乙型肝炎病毒DA逆转录酶基因特异基因变异检测方法的建立及评价.pdfVIP

中文摘要 乙型肝炎病毒DNA逆转录酶基因区特异基因变异 检测方法的建立及评价 摘 要 BVirus，HBV)逆转 目的：乙型肝炎病毒(Hepatitis 录酶(Reverse 门．门，nt738．749)基因变异，是1996年发现的一种HBV 耐药变异基因。该变异已被证实与长期使用核苷类药物， 如拉米夫定(3TC)直接相关。3TC作为治疗慢性乙型肝 炎(ChronicB，CHB)的酋选药物已被广泛应用 Hepatitis 于临床。但随着HBVYMDD耐药变异株的出现，患者对 3TC的敏感性将大幅度降低，并可最终引起病情复发甚至 死亡。因此获得和克隆HBVYMDD耐药变异基因，并建 立敏感性高、快速、实用的HBVYMDD耐药基因变异检 测方法，对于研究HBV耐药变异和指导临床用药有着极 其重要的意义。 方法：特异基因序列固相多聚酶链反应技术 solid PCR，SS--SPPCR)是目 (Sequence—specificphase 前国外应用较为普遍的一种核酸分子检测技术。该技术原 理系采用PCR技术，标记变异探针与患者DNA片断进行 液相杂交，杂交产物标记信号经酶联免疫吸附实验 (ELISA)放大显色，酶标仪读取光密度值(OD)值并 判定结果。此项技术敏感性、特异性方面与经典的 Southern Blot相当，而且具备简便、快速、对设备要求低 的优势，非常适合在我国临床常规试验室开展工作。我们 中文摘要 YMDD耐药变异基囚 将通过以下三个步骤建立检测HBV 的SS--SPPCR方法并进行灵敏性与特异性评价：1．HBV YMDD基因变异模式质粒的构建；2．SS—SPPCR实验条 件和方法的建立；3．SS--SPPCR灵敏性和特异性评价及实 YMDD基因变异模 际应用的评估。首先构建出常见HBV DNA一(ntl71--985)为目标 式质粒。选择野毒型HBV 克隆片段，设计合成外测扩增引物1对和内侧变异引物4 对。以HBV野毒型质粒(pMS)为模板，进行两轮PCR 扩增，产物经纯化回收后直接连接至pGEM．T克隆载体， 构建出HBV YMDD基因变异模式质粒：p-V垂g、p-Iatt、 P．1atc、P．Iata。转化大肠杆菌DH5(I，小量提取重组质粒 经酶切和序列分析鉴定。然后与pMS共同进行紫外定量 并计算拷贝数，并将5种质粒均稀释至同一拷贝数值备 用。SS--SPPCR检测方法主要包括三个环节：探针及引 物设计合成：液相杂交反应条件的确定；和ELISA检测 条件的确定。设计合成野毒和部分变异eDNA探针(P) 两组。一组丁．5’端标记生物素：包括PATO-Bio(检测pMS)、 酸序列相同但不作标记(PATG、PGTG、、PATT)。另设计合成 扩增引物1对，上游引物标记地高辛(Dig)。分别以4份正 常人血清提取的DNA、pMS，p-Iatt为模板于常规条件下 (55℃退火)进行PCR扩增。扩增产物5’端带有地高 辛，用作于液相杂交反应的DNA材料。液相杂交反应条 件主要通过改变杂交复性温度来选择。1．确定野毒型pMS 质粒液相杂交复性温度及SS—SPPCR阳性界值。选择杂交 复性温度为35℃、40℃、45℃，杂交lO个循环；以PATG 中文摘要 -Bl。与分别与4份正常人提取DNA的杂交产物、PATG探 针与pMS片段杂交产物的检测信号为阴性对照，PATG—Bi。 探针与pMS杂交检测信号为阳性对照，杂交产物经ELISA 检测。选择杂交检测反应模式最好的温度为pMS检测最 适杂交复性条件。计算SS—SPPCR阳性界值=均值+2．58 ×标准差。2．确定p-Iatt杂交检测条件。P州1-Bi0分别与正 常人血清DNA、pMS杂交检测信号作为阴性对照，用P棚， -Bl。与pMS和p-latt质粒混合物杂交检测信号作为阳性对