结核分枝杆菌快检测方法的研究.pdfVIP

同济医科大学 里主竺竺丝苎 ． 摘 要 自二十世纪八十年代中期以来，随着HIV蔓延、耐药菌株产生，世 界人口流动增强，结核病发病率、死亡率呈上升趋势，形势严峻，迫切需 要建立一种快速、灵敏、准确、经济的结核分枝杆菌(MTB)检测方法。 本实验包括三部分，即MTT方法的建立，分离培养—MTT法检测 抗酸分枝杆菌(AFB)与分离培养一增强化学发光法(ECL)检测MTB 的研究。 本文首次采用MTT法检测AFB，探讨了最佳反应条件：BCG与MTT 孵育温度为370c，孵育时间为4h，裂解MTr三苯基甲脂晶体时间为4h。 7／ml。 MTT方法的灵敏度为10 7H9 本文随后部分研究AFB快速分离培养法。实验中以Middlebrook 液体培养基为基础，加入选择性抗生素多粘菌素B、两性霉素B、头孢菌 NaOH处理后接种于培养基中，每7天用MTT方法检测一次，直至出现 阳性结果。 佣建立的新方法与罗氏培养基检测了50例临床痰标本，其中涂片阳 性和涂片阴性标本分别为7例、43例。最后共分离培养出41例AFB， Middlebrook 7H9液体培养基分离培养出了37例，灵敏度为90．24％，罗 氏培养基分离培养出了30例，灵敏度为73．17％，Middlebrook 7H9液体 培养基灵敏度高于罗氏培养基(PO．05)。 对于7例涂片阳性标本，Middlebrook 7H9液体培养基与罗氏培养基 均将其检出。43例涂片阴性标本，两种方法共分离培养出了34例AFB， Middlebrook 7H9液体培养基分离培养出了30例(88．24％)，罗氏培养基 7H9液体培养基检测涂片阴性标本的能力优于罗氏培养基。 、 ， 对所有阳性结果，Middlebrook 7H9液体培养基与罗氏培养基阳性平／ 同济医科大学 硕士掌位论文 ————————————————————————————————————————————————————————————一一 7H9液体培养基时间 ／均检出时间分别为14．57天、21．47天，Mi．ddlebrook 片阴性标本阳性平均检出时间分别为12天、15．17天，罗氏培养基为18 7H9培养基 天、22．52天，均有显著性差异(P0．05)。另外Middlebrook 与罗氏培养基污染率、假阳性率分别为2％、4％和2．63％、3．23％。 在本文最后部分，探讨了分离培养一EcL法检测MTB。实验中首先 建立ECL方法，将BCG稀释成系列浓度后提取DNA，固定于酶标微孔 板中，与特异性探针杂交后用ECL检测。本实验所用探针为MTB插入序 列IS6110中123bp长的DNA片段，具有很好的特异性。探针用辣根过氧 化物酶(HRP)直接标记，杂交后用增强Luminol／H202发光体系检测。 床标本经Middlebrook 7H9液体培养基分离培养后，可先用MTT方法检 测，如有AFB生长，再提取其DNA用ECL鉴别是否为MTB。 本实验模拟了30例临床痰标本，其中15例含BCG，5例含鸟～胞 例正常痰液，然后用分离培养一EcL法与PCR两种方法检测。对于分离 培养—EcL法，模拟临床痰标本首先经Middlebrook