毕赤酵母Δ-%2712-%2fω3-脂肪酸脱氢酶功能与结构研究.pdf

中文摘要 中文摘要 巴斯德毕赤酵母Gsll5(Pichia pastoris)作为一种能够产生多不饱和脂肪 酸亚油酸和q．亚麻酸的酵母菌株，是构建产多不饱脂肪酸的基因工程菌株的较 好选择。因此，有必要对毕赤酵母多不饱和脂肪酸的合成途径及其合成途径中 相关酶类进行系统的研究。 为研究巴斯德毕赤酵母中多不饱和脂肪酸的合成机制，根据已报道的真菌 来源的03．脂肪酸脱氢酶和毕赤酵母△12．脂肪酸脱氢酶同源序列中保守的氨基酸 序列设计简并引物进行PCR，结果得到全长为564bp，编码187个氨基酸的片 段。通过其编码的氨基酸序列的相似性搜索表明，所扩增片段为新的潜在的 03．脂肪酸脱氢酶基因的部分DNA序列。在此基础上，采用接头PCR的方法共 得到全长为2259bp的核苷酸序列信息，其中包括1248bp的氨基酸编码区和 924bp的潜在上游启动子区。同其他已报道的f．03-脂肪酸脱氢酶氨基酸序列对比 的结果和系统进化分析结果都表明：该序列可能编码一个完整的03．脂肪酸脱 氢酶。为了验证所获得序列的功能，将潜在的编码序列转化到INVScl受体菌 中进行表达。通过气相色谱(GC)和气质联用(oc．MS)分析表明：该序列所编码 的蛋白具有03．脂肪酸脱氢酶活性，能催化外源性底物亚油酸转化成Ct．亚麻 16884)。 酸。该基因序列已经注册到NCBI的GenBank中(序列接收号为EFl 为进一步验证该∞3．脂肪酸脱氢酶的底物特异性，分别加入不同的11．6类不饱和 脂肪酸作为底物进行诱导表达。结果发现PPc03不仅能够识别亚油酸作为底物 进行催化，也能够催化丫．亚麻酸、二高丫．亚麻酸和花生四烯酸生成相应的n一3 类产物，且催化活性大致相同。这说明毕赤酵母一．脂肪酸脱氢酶对于十八碳 和二十碳底物的有着同等的利用能力。 利用同源重组介导敲除的办法构建了巴斯德毕赤酵母△12一脂肪酸脱氢酶基 因缺失突变株和C03-脂肪酸脱氢酶基因缺失突变株，并对缺失突变株的总脂肪 酸进行了GC分析和Southern杂交验证。分析结果证明△12．脂肪酸脱氢酶是巴 斯德毕赤酵母中唯一催化油酸生成亚油酸的酶类，巴斯德毕赤酵母中只有∞3一 脂肪酸脱氢酶一种催化亚油酸生成a．亚麻酸的酶类。因此我们可以进一步推断 出巴斯德毕赤酵母体内多不饱和脂肪酸的代谢途径是：首先由A12脂肪酸脱氢 酶催化油酸生成亚油酸，然后103．脂肪酸脱氢酶催化亚油酸最终生成a．亚麻 中文摘要 酸。分别将巴斯德毕赤酵母△12．脂肪酸脱氢酶基因和一．脂肪酸脱氢酶基因转入 相应的缺失突变株中进行表达，总脂肪酸成分分析结果发现△12．脂肪酸脱氢酶 基因和一．脂肪酸脱氢酶基因的表达不仅可以弥补脱氢酶基因缺失突变株中相 应基因的缺失，而且回补株中缺失基因的产物占总脂肪酸的百分含量都相应的 有所提高。因此认为：通过缺失多不饱和脂肪酸脱氢酶基因构建突变株，然后 再将相应多不饱和脂肪酸脱氢酶基因置于强启动子后回补其突变，从而获得高 产相应多不饱和脂肪酸脱氢酶产物的工程菌株，是一种值得尝试的构建产多不 饱和脂肪酸基因工程菌株的方法。 Server 利用膜蛋白结构预测系统TMHMM V．2．对巴斯德毕赤酵母的一．脂 肪酸脱氢酶和△12．脂肪酸脱氢酶进行结构分析，并且参照前人对膜整合的脂肪 酸脱氢酶结构与功能关系的研究结果，确定△眩／∥．脂肪酸脱氢酶中三个组氨酸 保守区所在的亲水区和C端游离区所在的位置。构建将03．脂肪酸脱氢酶基因 的该部分序列替换成△12．脂肪酸脱氢酶基因中相应序列的嵌合体，并将其转入 酿酒酵母中进行表达，发现以033-脂肪酸脱氢酶为母体的嵌合体失去了03_脂肪 酸脱氢酶的活性，反而具有了△12．脂肪酸脱氢酶的催化功能。因此推断出决定 巴斯德毕赤酵母膜整合的03_脂肪酸脱氢酶脱氢机制的氨基酸序列属于脂肪酸 脱氢酶中三个组氨酸保守区所在的亲水区和C端游离区。进一步的比对巴斯德 毕赤酵母和克鲁维氏酵母中处于三个组氨酸保守区所在的亲水区和C端游离区 的033-脂肪酸脱氢酶／△12．脂肪酸脱氢酶氨基酸序列，选出酵母中具有03．脂肪酸 脱氢酶／△12