《生化实验技术》综合设计性实验论文解析.doc

《生化实验技术》综合设计性实验论文 班级组别： 生物技术122 学 号： 2012013456 姓 名： 钮群崛 指导教师： 汪财生 谭志文 斯越秀 完成日期： 2014-6-26 海藻活性多糖的分离纯化 摘要：海藻多糖属一类海藻提取物,应用价值很高,如:琼脂、卡拉胶、褐藻酸盐在工业上已长期使用。海藻多糖作为药物和药物中间体有具有潜在的功能。利用酶法去除多糖中的蛋白质并且运用酶法辅助提取多糖；采用苯酚—硫酸法，借助紫外分光光度计进行对多糖含量的测定。 关键词：海藻多糖，层析，透析，Sevag法，DEAE 1前言 多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成的化合物，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动四大基本物质之一，与维持生命功能密切相关。大部分植物多糖不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。多糖具有抗氧化性、抗病毒性、反互补特性，大量药理及临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，能激活免疫受体，提高机体的免疫功能，在用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好的优点。 多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。 本实验采用Sevag法(氯仿：正丁醇＝4：1混合摇匀)进行脱蛋白，用DEAE-纤维素层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖组分。 DEAE纤维素阴离子柱层板分离多糖的原理主要是其可吸附离子型物质，比如蛋白质、酸性多糖等，而作为大多数的中性多糖则可顺利流出，从而去粗取精、达到分离的目的。当然，DEAE的细度很细，也可起到分子筛的作用，但其分离效果会和柱高、洗脱溶剂、粒径的关系很大，效果并不很好，且在大量水冲的情况下，中性多糖基本均可洗脱下来。 多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该衍生物在波长490nm处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，采用比色法对多糖含量进行测定。 DEAE纤维素阴离子柱层板分离多糖的原理主要是其可吸附离子型物质，比如蛋白质、酸性多糖等，而作为大多数的中性多糖则可顺利流出，从而去粗取精、达到分离的目的。当然，DEAE的细度很细，也可起到分子筛的作用，但其分离效果会和柱高、洗脱溶剂、粒径的关系很大，效果并不很好，且在大量水冲的情况下，中性多糖基本均可洗脱下来。 2材料与方法 2.1材料与设备 2.1.1实验材料 干燥的海藻粉末 2.1.2试剂及配制方法 平衡缓冲液：0.01mol/L?Tris-HCl,pH7.2:用小烧杯称取1.211g?Tris，用50ml蒸馏水溶解，用50%盐酸调节pH7.2，移至1000ml容量瓶，并定容。洗脱液：A：0.1mol/L?NaCl,0.01mol/L?Tris-HCl,pH7.2:用小烧杯称取5.85g?NaCl，用0.01mol/L?Tris-HCl,pH7.2溶解，并定容至1000ml。B:?0.5mol/L?NaCl,0.01mol/L?Tris-HCl,pH7.2:?用小烧杯称取29.25g?NaCl，用0.01mol/L?Tris-HCl,pH7.2溶解，并定容至1000ml。标准葡萄糖溶液（40ug/ml）：称取0.4g葡萄糖，用蒸馏水定容至100ml,准确移取1ml定容后溶液于100ml容量瓶中，并定容，此时的溶液浓度为40ug/ml。6％苯酚溶液：取苯酚100?g，加铝片0.?1?g和碳酸钠0.?05?g，常压蒸馏,收集182℃馏分。称取该馏分(100%苯酚)6?g，置100?ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。??单糖标准品，浓硫酸，氯仿，正丁醇，乙醇（95%），磷酸二氢钠等，均为分析纯。 2.1.3实验器材 DEAE52,旋转真空蒸发仪，摇床，离心机，层析柱2.6cm*40cm，自动液相分析仪，玻璃板，分析天平，恒温水浴锅，紫外分光光度计，精密pH计等 2.2实验方法 2.2.1粗多糖的提取 热水浸提法（水提）：称取