天泰ⅱ号方抗大阿尔茨海默病作用及其机制的实验研究.pdf

中文摘要 hl 神经退行性变性疾病，其临床表现为记忆力进行性减退、学习困难、运算 障碍、失认失用、甚至生活无法自理等。随着全球人口的老龄化，AD已经 5 成为威胁老年人健康的第四大杀手。全球估计有100万人患此病，而这个 数目还在上升。该病不仅严重影响老年人的身心健康与生活质量，还给家 庭和社会带来沉重的负担，已引起全世界的普遍关注。我国已经步入老龄 大国，加强AD的研究对我国而言，不仅具有重大的现实意义，而且具有 深远的历史影响。 AD主要的神经病理改变有：神经元丧失、神经元纤维缠结(NFT)、 itic 大脑皮质和某些皮质下结构出现老年斑(SP)或称神经炎斑(Neur plaques，NP)、颗粒空泡变性(granulovacuolar l d 神经毡细丝(Neuropi 究认为AD发病的生物化学基础是细胞外的淀粉样蛋白(AD)沉着和细胞 内的微管相关蛋白一一Tau蛋白过度磷酸化相互影响的结果。 目前尚无有效的AD治疗药物，减少AD发病以预防为主。有资料表明 大多数的AD病例是由MCI(轻度认知障碍)发展而来，既然缺乏肯定的 治疗方法和药物，利用中医药治未病的优势进行AD针对性的早期干预应 该是有效的策略。导师吴正治研究员一直从事老年脑病的中医药研究，筛 选古今验方结合自己的临床开发出天泰Ⅱ号方，进行抗MCI和AD的药理 学相关研究。本人在导师过去研究成果的基础上主要进行该方抗AD的药 效学及其可能的机制研究。 本课题研究包括两大部分：一是动物实验研究。二是细胞生物学实验 研究。 一、动物实验研究 先用MorriS水迷宫实验进行动物筛选，将定位航行时间超过平均值 30％的大鼠剔除，剩余大鼠供实验用。 大鼠AD疾病模型制备。按1．5ml／kg体重腹腔注射3％的戊巴比妥钠 水溶液麻醉大鼠，将麻醉大鼠俯卧位固定在脑立体定位仪上，常规打开鼠 头顶部的皮肤，以前囟后3．6mm中线旁开2．5mm为颅骨标志点，用牙科钻 在左右两个标志点各钻一孔，将“老化的1u1 5mMAp：，嗡用微量注射 器在5分钟内注入颅骨骨膜下3．0mm海马组织并留针10分钟，术后常规 处理。第26天开始MorriS水迷宫实验，连续实验5天，将行为学实验结 果进行统计学分析。除正常对照组动物颈背部皮下注射O．9％生理盐水 150mg／kg体重。末次行为学实验结束后断头处死大鼠，取左半脑用4％多 聚甲醛固定，进行常规HE染色，观察脑组织结构、细胞的形态和海马CA2、 CA3区神经元数量，根据行为学和组织学实验结果评价AD模型的成功与 否。 在制备大鼠AD疾病模型成功的基础上，按以上方法制备大鼠AD疾病模 型。将大鼠随机分为7组，即天泰Ⅱ号方大、中、小剂量3个组，单味药(N0 o只大鼠(sD大鼠、 1药)组，AD模型组与正常对照组和假手术组，每组1 Ⅱ号方大、中、小剂量组大鼠分别灌胃给予1O％、5％、2．5％的天泰Ⅱ号方 1 10ml／kg，假手术组和正常对照组则以相同的方式给予同体积的生理盐水， 每日1次，连续用药30天。 从给药(天泰Ⅱ号方)第26天开始进行行为学实验，实验内容包括学 习训练、定位航行实验和空间探索实验三部分。末次行为学实验结束后断 头处死大鼠，取全脑。其右脑保存于液氮中，左脑用4％多聚甲醛固定。左 脑进行常规HE染色，观察脑组织结构、细胞的形态和海马CA2、CA3区神经 元数量；用免疫组织化学方法(sP法)研究大鼠前脑抗ChAT抗体阳性细胞 Ⅱ 数量的变化；用TUNEL法研究脑组织神经细胞凋亡的情况，凋亡指数。 用真核细胞裂解液裂解右脑组织20min抽提脑组织总蛋白，在4℃以 12000rpm离心1 0分钟，获取的上清即为含目的蛋白的混合物。使用蛋白质 印迹实验方法，经电泳、转膜和免疫反应、化学发光显示CHOP蛋白，用凝 胶图像分析仪检测。 另外，从假手术组、AD模型组、天泰