肝郁证模型大鼠马内差异表达片段的初步生物信息学研究.pdf

中文摘要 中文摘要 证候以中医藏象理论为基础，又指导着中医临床诊治的实施，是中医理论 的特色之～，因而成为近年来中医研究的热点。肝郁证是中医肝病的主要证候， 是临床常见的证候之一，具有重要的研究意义。作为一类复杂证候，肝郁证表 现不仅涉及肝本身病交，也关系到全身其它多脏腑系统的复杂病变。它可产生 高级神经中枢调节机制紊乱，涉及到神经、内分泌、循环、消化、免疫、感觉、 运动等多系统多方面改变。 随着目前现代医学水平的发展，基因组学、蛋白质组学、生物信息学的研 究工作已经成为医学中最为重要的研究方向。因此，利用这些技术研究证候理 论是当前一热点的方法。然而目前对肝郁证的研究大多数停留在部分已知基因 表达产物(受体、酶、细胞因子以及肽类等)改变的层面上，并没有针对肝郁 证这一复杂证候做系统、整体的分析与整合，远未揭示肝郁证的实质。而证候 的复杂表现应有其物质基础及作用机理。可能不是某一个或某几个基因独立发 挥作用的结果，而是由于基因组整体水平上的调控发生紊乱所致。 基于上述认识，本文主要从以下方面进行了研究： 理论研究 随着后基因组时代的来临，生命科学的研究重点已经从结构基因组学开始 转向功能基因组水平，这种更重视基因功能、更强调相互作用关系和整合的理 念，与中医的学术思想不谋而合。本文分别从整体观、动态变化过程、功能性、 个体化的角度对中医的证候理论与基因组学、蛋白质组学、生物信息学之间的 相似性做出了论述，力图通过以上论述，充实证候学研究的手段和方法，使学 者能从全新的角度和层面重新认定和评价中医证候理论。 实验研究 实验一肝郁证大鼠动物模型的复制。 在前期实验结果的基础上，本研究再次利用慢性不可预知温和应激方法重 复了肝郁证动物模型，并进行了1％蔗糖水摄取量的行为学测定。实验进行了 2次，实验动物均使用SD雄性大鼠，随机分为正常对照组(空白组)、应激模 型组(模型组)、应激模型+阿米替林组(阿米替林组)，应激模型+逍遥散组 (逍遥散组)，采用慢性温和不可预知应激方法造模。造模第l天与第22天 均测定了各组大鼠1小时1％蔗糖水摄取量。结果显示：实验初期，各组大鼠 1％蔗糖水摄取量经统计组间无差异，实验第22天，模型组1％蔗糖水摄取量 明显低于对照组；逍遥散组和阿米替林组摄取量则高于模型组，与对照组差异 不显著。肝郁证动物模型在行为学方面重复得到验证。 4 肝郁证模型大鼠海马内差异表达片段的初步生物信息学研究 实验二生物信息学分析 本部分对前期分离出的差异显示片段(1号与12号)，进行了初步的生物 行拼接，完成序列的拼接之后，对重新组装的eontig进行功能注释，注释过程 主要结合了以下几种方法：对新生序列进行Blastx检索，如果匹配理想，则 利用NCBI的数据库对基因功能注释；如果第一步骤中没有理想的匹配，进行 Blastn检索，匹配理想则完成注释：如果第二步骤中结果仍不理想，则利用用 Interprosean进行蛋白质功能域注释；在阻上三步完成后，可以进行一些后续 的分析。例如用KEGG的数据库对基因的调控网络作出初步的整合：如果完 成第一至第三步骤后，没有理想的结果，可以初步认为是新的基因序列。分析 转录产物；再迸一步对GSK3b与St39a15的功能加以研究分析后，提示这两个 基因有可能与肝郁证的发生、发展相关，机理有待进一步研究。 实验三差异表达片段的反转录巢式PCR检测 通过反转录巢式PCR对前期实验分离出的差异显示片段进行了验证，以发 现与肝郁证密切相关的基因表达片段，并验证实验二部分的生物信息学分析， 从而对肝郁证实质和机理进行研究。造模方法同实验一，动物造模末次处理后， 快速断头处死，冰上取脑，分离海马，液氮冻存备用。用Trizol试剂一步法 提取模型大鼠海马总RNA，并将RNA反转录为eDNA，并针对前期实验分离 出的差异显示片段设计引物，利用此引物与内参(p—aetin)引物进行双管 PCR扩增。扩增完成后，将PCR终产物测序以验证PCR扩增的准确性，之后 使用凝胶分析软件对电泳图片作灰度扫描，以目的片段，内参作为相对表达量， 分析比较四组相对表达量的高低。本次实验对1号片段进行了验证，实验结果 与前期DDRT—PCR的结果基本吻合，可以认为1号片段模型组表达量高于空 白组，至于阿米替林组表达量与空白组的关系。尚不能认为阿米替林组高于空 白组。 综上，逍遥散对慢性不可预知温和应激状态下机体各方面