生物大分子相互作用新技术课件.pptVIP

生物大分子相互作用分析新技术 1、荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET） FRET现象 实验设计 FRET的能量供体和受体 FRET的能量供体和受体 2、表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR） SPR 现象 优点：分子无需标记； 高通量（蛋白质芯片） 检测对象类型广泛 可实现实时检测 可进行相互作用动力学分析 SPR imaging 检测原理 Fixed angle, fixed wavelength D%R Reflectivity change as basis of measurement SPRimager 系统 Rotating Stage 流动相（含待分析物） Gold-coated glass SPRchip? p-pol light 棱镜 分子探针阵列 GWC’s “SPR Imaging” 技术 Bioarray Terminology SPRchip? glass gold attachment chemistry Biosensor Analyte Probe Monitoring Changes: Difference Images = SA+Bi m-PEG n-PEG SA SA Probe Array Probe Array + BiotinT7 Difference Image: signal due to binding of BiotinT7 to Streptavidin A B A B - Monitoring Changes: Image + Chart Value of Real-Time Monitoring Protein Array,End of Experiment Ag SA Con Add Biotinylated Antibody D%R min End-point measurements miss all the action SPRimager 系统 * * White-light (left) and fluorescence (right) photographs of a coral, Roatan, Honduras. Note the yellow-fluorescent area in the photograph on the right that is not evident in the other image. FRET技术能够对在固定细胞中的蛋白质相互作用或存在于活细胞内蛋白质间实时相互作用进行原位分析提供了唯一检测方式，能用于检测由于生物刺激引起的蛋白质相互作用变化。 直到不久前，分子细胞生物学家还只能依赖几种有限的技术手段解决特异蛋白质-蛋白质相互作用中的问题，这些技术都需要使用化学交联的试剂或抗体。但是，像免疫沉淀和亲和层析等此类技术中最大的难题，就是无法保留蛋白质在完整细胞中所具有的正常生理条件，而且，这些方法也无法提供相互作用蛋白质空间分布的信息。免疫细胞化学共定位可以给出两个特定蛋白质在同一细胞部位的间接证据，但是，同样无法直接说明这些特定蛋白质之间是否发生了相互作用。FRET测定则可以在完整细胞中解决这些问题。 FRET是指当供体（donor）的发射光谱与受体（acceptor）的吸收光谱相重叠，并且供体与受体间的距离在几个原子直径范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移。其原理是，以适当频率的光能照射供体，会有效地产生振荡偶极子，与近处的受体偶极子产生共振。这种偶极子与偶极子之间的相互作用将供体荧光团的能量非放射性地转移到受体荧光基团。对于给定的供体-受体对，供体丢失的能量就是受体得到的能量。据此，人们可以通过检查和计算FRET值来测量分子内和分子间的距离，在活体研究大分子之间的相互作用。 应用PRET技术，还可以在活细胞中实时观察一系列可逆的分子过程，如同时检测信号分子的二聚体形成，细胞的信号级联通路：包括受体与配基的相互作用、构型依赖的受体激活、信号分子的装配、细胞内效应予以基因转录的激活等。这对于我们理解生物大分子的结构和功能非常的重要。FRET系统同时提供活细胞内分子在时间和空间方面的信息，这是在传统的免疫共沉淀、酵母双杂交、噬菌体展示等技术所不能实现的。 当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET 程度