绵羊卵巢microRNA的克隆及表达分析.pdfVIP

２１８４ 核 农 学 报　 ２０１４，２８（１２）：２１８４ ～２１９１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＮｕｃｌｅａｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）１２⁃２１８４⁃０８ 绵羊卵巢 ｍｉｃｒｏＲＮＡ 的克隆及表达分析 １ １ ２ ２ ３ １ １ 常卫华　 胡俊杰　 王娟红　 曹会萍　 马友记　 张　 勇　 赵兴绪 １ ２ （ 甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州　 ７３００７０； 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州　 ７３００７０； ３甘肃农业大学动物科技学院，甘肃 兰州　 ７３００７０） 摘　 要：ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）是广泛存在于真核生物中长约１８～２５ 个核苷酸的一类非编码ＲＮＡ，调控基 因转录后表达。 目前，对ｍｉＲＮＡ 的鉴定、功能分析及机理调控的研究已成为生物学领域的热点。 为丰 富绵羊ｍｉＲＮＡ数据库、研究ｍｉＲＮＡ对季节性繁殖动物繁殖活动的调控作用及调控机理提供基础。 本 研究通过克隆法构建绵羊卵巢ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ 文库，并进行生物学分析；利用Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测ｍｉＲＮＡ 在卵巢组织中的表达。 试验成功构建绵羊卵巢ｍｉＲＮＡ 的ｃＤＮＡ 文库，获得３０ 条绵羊ｍｉＲＮＡ 序列。 ｍｉＲＢａｓｅ数据库序列比对，２０条ｍｉＲＮＡ序列与绵羊已知ｍｉＲＮＡ 同源保守，鉴定为绵羊已知ｍｉＲＮＡ。 其 中ｏａｒ⁃ｍｉＲ－３９５５－５ｐ 在其它物种中未注释，鉴定为绵羊特异性ｍｉＲＮＡ。 通过比对及二级结构分析鉴 定了绵羊１０ 条新ｍｉＲＮＡ，其中ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００１－５ｐ 只与牛ｂｔａ⁃ｍｉＲ－２２８５ 具有一定的同源性。 ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ结果表明１０ 个ｍｉＲＮＡ（５ 个已知ｍｉＲＮＡ及５ 个新ｍｉＲＮＡ）在绵羊卵巢组织中均有表达， 但ｏｖｉｓ⁃ａｒｉｅｓ⁃ｏｖａｒｙ⁃ｍ０００３－３ｐ 的表达量显著高于其它９ 个，推测该新ｍｉＲＮＡ对绵羊卵巢发育或功能发 挥具有重要的调控作用。 试验结果对绵羊ｍｉＲＮＡ 的进一步研究具有一定的理论指导和现实意义。 关键词：绵羊；卵巢；ｍｉｃｒｏＲＮＡ；克隆；生物信息学；实时荧光定量ＰＣＲ ＤＯＩ：１０１１８６９／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００⁃８５５１２０１４１２．２１８４ 　 　 ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是存在于真核生物中长度约 ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡｓ （ｓｎｏＲＮＡｓ）。 卵巢上大约 ７０％ 的 为２０～２５个核苷酸的一类非编码小分子 ＲＮＡ，根据 ｐｉＲＮＡｓ是由位于重复区域的多重基因编码的。 这些 其与靶基因的互补程度或抑制靶基因翻译或降解靶基 卵巢非编码ＲＮＡｓ 的表达和结构表明了其在卵泡的发 因的转录物进而发挥调控作用［１－４］。 １９９３ 年，Ｌｅｅ 育和受精方面起着重要的作用。 ２００８ 年，Ｍｉｓｈｏｍａ ［５］ ［８］ 等 人用经典的定位克隆的方法在线虫 （Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ） 等 学者报道，利用小鼠的卵巢和睾丸，通过克隆的 中首次发现了ｌｉｎ⁃４ 基因，并通过定点突变发现 ｌｉｎ⁃４ 方法分别获得６ ６３０ 条序列（１５９ 个已知 ｍｉＲＮＡｓ 基 并不编码蛋白，而是产生一种小 ＲＮＡ 分子。 ２０００ 年， 因）和１０ １９２条序列（１５４个已知ｍｉＲＮＡｓ基因），检测 ［６］