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PCR技术及重组DNA技术 PCR技术 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构（发夹结构）。 （5）两引物间避免有互补序列（二聚体）。 （6）3’端一定要与模板严格配对，5’端可引入突变，加酶切位点等。 3. 得到的引物结果 引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC 纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。 普通PCR：OPC纯（95%） 较长引物（大于50个碱基） ：PAGE纯（95%） 经过修饰或标记的引物：HPLC纯（ 99%,但价格昂贵） 引物浓度：0.1-0.5 ?mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 （3）耐热DNA聚合酶 1）Taq DNA聚合酶（Taq polymerase） ： 95℃的半寿期为40min 最适温度（72℃）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸 酶活性（受多种因素影响）： 5’→3’方向的聚合酶活性， 5’→3’方向的外切酶活性和逆转录酶活性， 非模板依赖性活性，可在双链PCR产物每一条链的3‘端加上单核苷酸尾，使PCR产物的3’端突出一个单A核苷酸尾 2）其他的耐热聚合酶 Pfu DNA聚合酶 ：具有3’→5’外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于2kb的片断扩增。 Vent DNA聚合酶：又称Tli DNA聚合酶，该酶耐高温且具有3‘-5’外切酶活性的校对功能，其保真性较Taq DNA聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（12kb）的功能较强。 思考题： 1.一次特异性很好的PCR后，所得产物的长度都是一样的吗？ 2.影响PCR反应成败的因素有那些？ 重组DNA技术 重组DNA技术的概念 重组DNA技术的基本条件 工具酶 目的基因 运载体 用于基因转移的受体菌或细胞 重组DNA技术的基本过程 举例说明 （一）工具酶 （二）目的基因 （三）运载体 （四）用于基因转移的受体菌或细胞 （一）重要的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 进行DNA重组的目的主要有两方面： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 这些使我们感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。 1.表达载体: 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 2.克隆载体: 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 运载体应具备的条件： 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有与特定受体细胞相适应的复制点或整合位点 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有合适的筛选标记 （四）用于基因转移的受体菌或细胞 常用受体类型： 大肠杆菌：背景清楚，生长迅速，培养简单等，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。 酵母菌：具有真核生物特性，背景清楚，生长迅速，培养简单，遗传稳定，可用于基因的克隆，表达，基因文库的构建等，是DNA重组实验和基因工程的重要的真核性受体菌。 哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）：与人的亲缘关系近，分子表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统；细胞培养条件苛刻，生长缓慢；适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究，是DNA重组实验和基因工程的主要的哺乳动物受体。 目的基因的获取和体外重组 化学合成法：较短的基因（60-80bp） 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。 基因组DNA文库 cDNA文库 聚合酶链反应 5.T-A克隆 T-A克隆策略是一种直接将PCR产物插入到载体中的方法。 二）转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法： 磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 :操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达。但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件。 脂质体转染 :脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。 显微注射:转