RTPCR(包括引物设计).ppt

实验步骤 流程示意图 反应体系 dNTP?Mixture (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) DEPC H2O 上机操作 运行程序 结果分析 结果分析 TaqMan法举例 材料准备 从正常肺组织中提取的总 RNA 从肺癌组织中提取的 总RNA -Trizol -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮 -RNA保存液 小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材 最常用 下游应用：是否检测其它基因？ 检测何种剪接体？ 是否会有二级结构干扰？ 检测灵敏度是否足够？ 逆转录 逆转录引物选择 常用 一步法 or 两步法？ 两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。 推荐：工作的初期阶段 RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX 一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段 （实际上：不推荐） RealSuper 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX PCR体系Ma