肺癌相关抗原的选及鉴定.pdfVIP

郑州犬学2007年硕J：论文 中文摘要 肺癌相关抗原的筛选及鉴定 硕士研究生王鹏 导 师张建营教授 导 师 组王凯娟教授 代丽萍副教授 研究方向肿瘤流行病学 郑州大学公共卫生学院郑州450001 中文摘要 背景与目的 肿瘤抗原的寻找一直是肿瘤免疫学研究中面临的重要课题。Sahin报告的 ofrecombinantcDNA SEREX(Serologicalanalysis expressionlibraries)方法是从体 液免疫的角度寻找肿瘤抗原，为寻找肿瘤抗原提供了～种全新的途径。该方法已 经用于多种类型的肿瘤抗原的筛选及鉴定，并发现了一些新的肿瘤相关抗原，显 示出良好的应用前景。 肺癌是全球最普遍的恶性肿瘤之一，发病率和病死率均占各种恶性肿瘤之 首，从确诊到死亡，其五年存活率不到15％，如此高的死亡率主要原因是肺癌难 以早发现、早治疗，且预后差。目前肺癌早期诊断的方法有限，因此寻找新的更 具优势的肿瘤相关抗原用于肺癌的早期诊断是急需研究的课题。 用SEREX法筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原的研究在国内外较少。本研究以 肺癌患者的血清筛选肺癌组织cDNA表达文库，鉴定出肺癌表达的肿瘤抗原，并 对其中的部分候选抗原做进一步的血清lgG抗体检测反应分析，期望为8市癌的早 期诊断和预后提供新的标记物，为肺癌疫苗的研制及免疫效果监测打下基础，并 且为探讨肺癌发生、发展的分子机理提供依据。 方法 一、肺癌相关抗原的异体血清筛选 郑州大学2007年硕上论文 中文摘要 1．将肺癌cDNA表达文库铺板，转膜，异丙基．B．D．硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导蛋白质表达，3％脱脂奶粉封闭，同1：100稀释的预吸收血清反应后，与1： 5000稀释的二抗反应，在二氨联苯胺(DAB)的作用下显色，抗原抗体复合物处 呈现紫蓝色。重复铺板和筛选3次，直到获得阳性重组噬菌体。 2．挑取阳性噬菌斑，噬菌斑块于SM缓冲液中4℃保存。阳性克隆经过体内 SK．噬菌粒。 剪切，成为pBluescript I、EcoR 3．提取质粒，Xho I双酶切初步鉴定插入片段的大小。 行同源性比对分析。 二、筛选出的肺癌抗原的初步血清反应分析 1．将第三轮筛选获得的阳性重组噬菌体铺板，转膜，IPTG诱导蛋白质表达， 3％脱脂奶粉封闭，分剪成大小为lcmx2cm的100份，分别与50例肺癌患者、 50例正常人预吸收血清反应后，与l：5000稀释的二抗反应，在二氨联苯胺(DAB) 的作用下显色，抗原抗体复合物处呈现紫蓝色。 ， 2．统计学处理：比较每个克隆在肺癌病例和正常血清的阳性率，肺癌病例 的阳性率高于正常血清的是阳性反应克隆。将筛选到的阳性反应克隆进行联合检 测，测定其灵敏度和特异度。所有数据采用SPSSll．0软件包处理，统计学分析 采用f检验、四格表的确切概率法。 结果 1．经过三轮筛选，从5x105pfu／ml的文库筛得70个阳性克隆，其插入片段 括26个功能未知的基因，2个可能的新基因，35个功能已知的基因。在已知功 能的基因中，有1个基因与肺癌的发生、发展关系密切；34个基因报道与细胞 的分化、代谢及信号转导等有关系，与其它肿瘤的发生、发展有关。 2．在35个功能已知的基因中选择5个肺癌候选抗原基因，用50例肺癌患 者和50例正常人血清对它们介导的IgG免疫反应进行检测、分析，得到3个阳 性反应的肺癌相关抗原克隆。 3．把这3个阳性反应抗原克隆联合起来分析，发现同时进行检