第二章基因工程制药1.pptVIP

2．pUC质粒载体 pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5，端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 （1）来自pBR322质粒的复制起点(ori)； （2）氨苄青霉素抗性基因(ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点； (3) 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因； （4）位于lacZ基因中的靠近5”端的一段多克隆位点(MCS ，multiple cloning sites)区，但它并不破坏该基因的功能(图)。 （2） pUC质粒载体的优点 与pBR322质粒载体相比，pUC质粒载体系列具有许多方面的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。其优点概括起来有如下三个方面： 第一、? 具有更小的分子量和更高的拷贝数? 第二，适用于组织化学方法检测重组体 第三，具有多克隆位点MCS区 Ampr ori pUC18 (3 kb) MCS (Multiple cloning sites, 多克隆位点） Lac promoter lacZ’ …ACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA… . T h rA s n S er S e r Val Pro Gly Asp Pro Leu Glu Ser Thr Cys Arg His Ala Ser… EcoRI SacI KpnI SmaI XmaI BamHI XbaI SalI HincII AccI PstI SphI Lac Z The ORF of the inserted gene has to be in the same direction as that of the lacZ A fusion protein contains the N-terminal sequence of lacZ and the inserted ORF will be produced 噬菌体载体 插入型载体:只具有一个限制酶位点可便于外源DNA插入的载体.λgt10、 λgt11 用于克隆〈10kb的外源DNA，cDNA及小片段DNA 取代型载体:含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代的载体。 λEMBL 克隆真核生物染色体DNA 随着体外包装技术和寡聚核苷酸合成技术的发展，人们已经构建了许多带有多克隆位点的λ噬菌体载体，现在常规使用的λ噬菌体载体，不少既可用作插入型又可用作置换型。总之，多克隆位点的引入不仅极大地扩展了λ噬菌体的克隆范围，同时还大大地简化了其操作技术。 5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。） cDNA文库的筛选 同源探针： - 表达基因差异显示技术设计的探针：DDRT-PCR 反向引物为5’-oligo(dT)MN-3’引物（M, dA/dG/dC； N, dA/dG/dT/dC正向引物为随即核甘酸序列 - 利用已知基因的同源序列设计的探针： 特异性抗体筛选 噬菌体表面展示技术 酵母双杂交技术 酵母单杂交系统 cDNA文库的建立过程 AAAAAAA TTTTTTTT RNA提取 分离mRNA Oligo dT或随机引物合成cDNA第一链 合成cDNA第二链 补平cDNA链末端 连接接头 连接噬菌体载体 包装噬菌体 感染、裂解宿主细胞 参数测定 分装、保存 转化或感染宿主菌 培养分离，形成菌斑或噬斑。 （文库所形成的噬斑实际上要密得多） 利用文库克隆目的基因 文库铺皿培养 形成噬斑 转膜 核酸杂交或抗体反应 获得阳性克隆 ＊核酸杂交适用于已知部分序列的目的基因克隆。＊抗体反应适用于未知序列的但已经获得相应抗体的目的基因克隆。 放射性探针进行得第一轮筛库 在对应的培养皿上挑出相应的噬斑 扩大培养 由于挑出的噬斑不能保证是单个噬斑，所以必须 进行第二轮筛库第二次的铺皿密度要小得多，以保证能够获得单斑 在对应的培养皿上挑出相应的噬斑 RTPCR法： mRNA经反转录合成cDNA第一链，然后在特异性引物协助下，用PCR进行扩增，特异的合成目的cDNA 链。 对已发现基因的改造 通过对基因的功能相关区域研究，并采用基因修饰技术和点突变技术进行基因新功