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分子生物学常用技术 3.1 凝胶电泳技术 3.2 分子杂交技术 3.3 PCR技术 3.4 生物芯片 3.5 基因文库构建 3.6 DNA序列测定 3.3 PCR 技术 3.3.1 聚合酶链式反应的原理 3.3.2 PCR体系 3.3.3 PCR反应条件优化 3.3.4 PCR类型 以两条互补的DNA为模板，引物是从3`端开始延伸，其5端是固定 的，3`端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。 进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链 (即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5`端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3`端被固定了止 点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形 成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数 倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略 不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片 段供分析与检测用。 PCR扩增特异DNA的原理 PCR扩增特异DNA的原理 反应中使用10～50mmol/L Tris.CL，主要靠其调节pH使Taq DNA聚 合酶的作用环境维持偏碱性。在反应体系中加入适量10%的二甲基 亚砜，虽然对聚合酶活性有一定抑制作用，但可以减少模板二级结 构，提高PCR反应特异性。 3.3.3 PCR反应条件优化 （一）循环参数 1、变性：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。 一般情况下，93℃～94℃ lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 2、退火：变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发 生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结 合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于 引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个 核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较 为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　　　　 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板 间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～ 60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 3.延伸： Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　　　　　 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子　　　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子　　　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子　　　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为 72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的 时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延 伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延 伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓 度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 4.循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于 模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越 多，非特异性产物的量亦随之增多。 （二）PCR反应特点 1.特异性强： PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因 的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物 链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较 高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也 就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因 区，其特异性程度就更高。 2.灵敏度高： PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12) 量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞 中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 3、简便、快速： 　PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好 后，即在PCR仪和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位 素，