动物细胞工程制药.ppt

第一节 概述 一、动物细胞工程的发展简史 1907年，Harrison首先培养了神经管区细胞，并观察到从中长出的轴突细胞 神经纤维 ，他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志。 1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于细胞培养的生长促进作用，并首次把无菌技术引入细胞培养技术中。 1950年后Earle等分别建立了Hela等多种细胞系 cell line 动物细胞培养从50年代起步，已成为普遍技术 新的核酸技术，免疫，电泳等技术使细胞培养技术从细胞水平进入分子水平 1986年，传代细胞Namalwa（Burkitt‘s 淋巴瘤细胞）生产的干扰素批准临床 猴肾细胞Vero生产疫苗 1987年，杂交瘤细胞生产抗体 1988年后，传代细胞生产基因工程产品t-PA、EPO、VIII 二、动物细胞工程制药的基本概念 （一）动物细胞工程制药 目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过80% ，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等 动物细胞工程制药包括： 培养细胞获得多肽和蛋白药物 转基因动物生产疫苗，多肽和蛋白药物 动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞核移植技术、动物细胞反应器，动物克隆，染色体改造，基因转移，转基因动物技术和细胞大规模培养技术等方面 最基本的有细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术三项技术 （二）动物细胞的分类 1. 贴壁依赖性细胞:包括成纤维细胞型，上皮细胞型。生长于支持物表面。 2. 非贴壁依赖性 也称悬浮细胞 这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织，许多肿瘤细胞等均属于此类。细胞一般呈圆形。 3.兼性贴壁细胞 有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养。如中国仓鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。 （三）动物细胞的培养特征 1.比微生物细胞大，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差。 2.倍增时间长，生长缓慢，易污染，培养时添加抗生素 3.培养基要求高，易污染。 4.培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在。 5.产物分泌性 6.蛋白后修饰 细胞培养基本技术 1.原代培养 （1）组织块培养法 （2）单层细胞培养法 2.传代培养 3.克隆培养 饲养细胞 细胞的冻存与复苏 在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。 低温保存的关键：在于通过0~-20℃阶段的处理过程。 在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 第二节 生产用动物细胞 一、生产用动物细胞的获得 （一）非基因工程细胞的获得 1.原代细胞 primary cell 直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液 1g组织约有109个细胞 增殖能力有限，需要大量的动物才能增加产量，费钱费劳力, 限制了它的应用。 动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞等 适合药物检测 2.传代细胞系 passage cell 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株 continuous cell lines, CCL 。 染色体组型是2n的核型,二倍体细胞系 具有贴壁依赖和接触抑制的特性 有限的增殖能力，50代 无致瘤性 一般从胚胎中获得，有限传代 WI-38, MRC-5, 2BS等。 WI-38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系 传代细胞在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处, 有时是从肿瘤细胞衍生而来, 由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性, 因而数十年间未允许传代细胞用于生产。70年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性 现在CCL已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系。 3. 转化细胞系 transformant cell 通过某个转化过程形成的，失去正常细胞的特点。由于染色体的断裂变成异倍体，获得无限增殖的能力 自发的：正常细胞中自发的转化形成有无限生命力的细胞系；多发生于啮齿类细胞动物 人为转化：采用某些病毒SV40或某些化学试剂 从动物肿瘤组织中建立的细胞系 转化细胞为永生化细胞，无限细胞系，连续细胞系 转化细胞具有无限生命力，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求低，更适于大规模工业化生产 在生物制药中，可通过改造宿主细胞特性，如延长细胞周期, 提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产量。 Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞。 （二）基因工程细胞系的构建 在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞，和采用基因工程手段构建的各种工程细胞 基因工程细胞系：用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得