WesternBlot实验技术要点.ppt

Western Blot 实验技术及常见问题分析 Western Blot定义 Western Blot基本原理、操作流程及注意事项 Western Blot常见问题分析 Western Blot定义 主要是利用电泳分离不同的蛋白组分，并将分离所得的蛋白质转移到固相支持体上，通过特异试剂(抗体)作为探针，对靶蛋白分子进行检测的一种方法。 Western Blot基本原理、操作流程及注意事项 蛋白样品的提取及处理 SDS电泳 样品的印记--转膜 封闭 免疫检测 一、蛋白样品的提取及处理 蛋白浓度测定方法 Western Blot基本原理、操作流程及注意事项 蛋白样品的提取及处理 SDS电泳 样品的印记--转膜 封闭 免疫检测 电泳设备 Western Blot基本原理、操作流程及注意事项 蛋白样品的提取及处理 SDS电泳 样品的印记--转膜 封闭 免疫检测 膜的选择 转膜后检测--丽春红S染色 Western Blot基本原理、操作流程及注意事项 蛋白样品的提取及处理 SDS电泳 样品的印记--转膜 封闭 免疫检测 四、封 闭 将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的蛋白质结合。 Western Blot基本原理、操作流程及注意事项 蛋白样品的提取及处理 SDS电泳 样品的印记--转膜 封闭 免疫检测 把封闭好的膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液孵育。摇床上缓慢摇动，4℃过夜。 用洗膜缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10min。 把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入二抗溶液孵育。摇床上缓慢摇动，室温2h。 用洗膜缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10min。 化学发光法(ECL) ECL显色原理：(二抗用HRP标记)反应物为过氧化物+鲁米诺，如果遇到HRP即发光，可使胶片曝光显影。 影响抗原抗体反应的因素 电解质电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。 酸碱度抗原抗体反应需要适宜的pH值环境，一般为pH6.0~8.0。 温 度温度升高可使反应加速，但温度高于56℃时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。 Western Blot基本原理、操作流程及注意事项 蛋白样品的提取及处理 SDS电泳 样品的印记--转膜 封闭 免疫检测 非特异条带多 抗体浓度过高 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 原因 对 策 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 蛋白带型条状 上样过量 样品沉淀 样品中的污染 制胶不佳 原因 对 策 降低上样量 加大样品中的SDS浓度 离心样品 确保灌胶均匀 * * 细胞经预冷的PBS漂洗 收集细胞加入蛋白裂解液，冰上裂解 测定蛋白浓度，加入上样缓冲液 100℃水浴加热10min 12000g 4℃离心10min，取出上清液 组织块迅速置于预冷的PBS漂洗 组织称量后加入相应体积的 裂解液进行匀浆 （冰上） Bicinchoninic acid ( BCA ) 法 灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合 物稳定性俱佳，且受干扰物质影响小。BCA法的显著 优点是不受去垢剂的影响。 Bradford 法 反应迅速，2min即可达到平衡并在1h内保持 稳定。操作简便，只需要一种反应试剂。 SDS 蛋白样品的处理（上样缓冲液） β-巯基乙醇或DTT 溴酚蓝 蔗糖或甘油 样品制备注意事项 制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。 样品处理中使蛋白质充分变性，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。 样品建议分装冻存，避免反复冻融。 二、SDS电泳 SDS凝胶的制备过程 分离胶的制备 胶上层用水封闭，同时注意气泡 浓缩胶的制备 36-94 7.5 12-60 12 线性分离范围(kD) 分离胶凝胶浓度（％） 考马斯亮蓝染胶 SDS电泳注意事项 加入试剂后摇匀，防止部分胶块聚合不均匀，摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多氧气。 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀。 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白质带的拖尾现象。 为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 低电压短时间的预电泳（恒压10-20V，20-30min），清除凝胶内的杂质。 三、样品的印记--转膜 半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样