喹叨啉衍生物在稳定DNAG四链体及下调致癌基因cmyc中的作用.docVIP

喹叨啉衍生物在稳定DNA G-四链体及下调致癌基因c-myc中的作用 欧田苗，Yu-Jing Lu，Chi Zhang，黄志纾，Xiao-DongWang，谭嘉恒，Yuan Chen，Dik-Lung Ma， Kwok-Yin Wong，Johny Cheuk-On Tang，Albert Sun-Chi Chan，古练权 中山大学药学院，中国广州510080；国家医学和分子药理学重点实验室，中国深圳； 香港理工大学应用生物学及化工系，药物发现及合成分子生物学技术研究所，中国香港。 接收日期：2006.8.22 在特定癌基因的启动子区域稳定G-四链体的结构是抗癌药物设计的一个新兴领域。人体的c-myc基因为癌基因，而G-四链体已被证明为该基因的转录控制元件。本实验主要研究喹叨啉衍生物与c-myc基因G-四链体的相互作用。实验结果表明，这些喹叨啉衍生物具有诱导/稳定c-myc基因G-四链体的作用，而G-四链体能下调c-myc在Hep G2细胞株中的表达。实验发现侧链具有末端氨基的喹叨啉衍生物在无钾离子的条件下，可以特异性的结合双核苷酸loop异构体。分子模拟实验揭示了喹叨啉衍生物与G-四链体的结合方式是通过3’位的末端堆叠。除此之外，喹叨啉衍生物带正电荷的侧链对含拓扑四链的loop异构体的选择性及提高稳定性方面起到了作用。 简介 人类的c-myc基因及其产物是细胞增殖和生长的调控中心。C-myc的异常表达被认为与多种恶性肿瘤的形成有关。位于c-myc的P1启动子区域上游中的核酶超敏感元件III1 (NHEa III1)控制着c-myc的80-90%的转录活性。核酶超敏感元件III1是一个富G的含有27个碱基对的序列，可以形成分子内G-四链体结构并起到转录抑制因子的作用(图1)。通过使用端粒酶抑制剂形成/稳定特定的G-四链体结构可以抑制c-myc基因的转录活性，如Telomestatin，TMPyP4，TMPyP4。我们课题组选定了天然产物白叶藤碱及其衍生物(a-j)作为端粒酶抑制剂以诱导/稳定端粒DNA的G-四链体结构(图2)。在本实验中，为了研究喹叨啉衍生物与NHEa III1 DNA的相互作用，将采取聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，圆二色谱(CD)，聚合酶链式反应终止实验(PCR stop assay)，增殖实验，逆转录PCR(RT-PCR)及分子模拟等手段。 如下面所要阐明的那样，喹叨啉衍生物具有诱导/稳定NHEa III1DNA的G-四链体结构作用，并能在肝癌细胞株Hep G2中抑制c-myc基因的表达。同时我们研究了侧链带有不同末端基团的喹叨啉衍生物，从而探讨其与不同核酸loop异构体结合的选择性。此外，采取分子模拟实验来探讨喹叨啉衍生物与c-myc基因G-四链体的结合方式，其中可能涉及到π—π堆叠及静电作用。 图1. NHEa III1在c-myc基因中的位置及G-四链体在该区域的生物学功能。如下所示为富嘌呤Pu27-mer序列的编号及截断的Pu18-mer。当c-myc启动子区域有G-四链体形成时，转录将被阻断。 结果与讨论 2.1喹叨啉衍生物对NHE 1113 G-四链体结构的诱导/稳定作用 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来验证喹叨啉衍生物是否与低聚体Pu27相结合5’-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG-3’，见图1G-四链体结构的形成。将低聚体Pu27分别与衍生物a-j在Tris-10mM ph7.4)中孵育至少4小时或在100mM KCl溶液中与衍生物进行孵育。 根据先前类似实验条件下获得的凝胶迁移数据及钾离子诱导下G-四链体的迁移标准，主要的条带分别被认为是高阶结构、单链结构(ssDNA)及分子内G-四链体结构(intra-G，见图3)。 根据Pu27与衍生物在无钾离子条件下迁移的变化所示，所有的衍生物对核苷酸Pu27均表现出相互作用的能力(图3a)。在对照组（未给药）出现三条主要条带，分别代表高阶结构、单链及分子内G-四链体结构，前两条条带十分明显，而后者条带并不明显(图3a)；与此相反，衍生物a-j组中代表分子内G-四链体结构的条带与对照组（未给药）相比更加明显，这表明衍生物a-j可能可以诱导两种分子内G-四链体结构的形成。 目前已报道，Pu27在100mM KCl条件下可以形成分子内G-四链体结构。在本研究中，经100mM KCl孵育后，经处理的样品与对照组的主带没有发生显著变化，这说明所有的喹叨啉衍生物都无法改变由KCl诱导形成的Pu27的G-四链体结构。 据报道，通过双突变实验发现NHE III1中具有生物相关性的G-四链体以四种loop异构体A、B、C、D的动态混合的形式而存在，见图4，且四种异构体对稳定c-myc启动子区域NHE III1的沉默元件均起到助力。