HE常规切片规范化操作.docVIP

HE常规切片规范化操作 ? 浙江大学附属第一医院病理科 丁伟 ?病理诊断学发展到今天，出现了大量的辅助诊断手段，但最重要的还是HE切片。由于HE切片是一个传统而又经典的方法，步骤相同，所以很多人会觉得没什么好学的，其实每个人在具体操作过程中，多多少少会有一点不相同之处，正是由于这一点不相同之处，才使得切片质量各有千秋，这就是所谓的经验。随意性大，质量不稳定。病理技术有很多小窍门，有的是在牺牲制片质量的前提下发明的，使用者往往自己不清楚。各个地方的操作方法不同，习惯不同，最终导致制片质量各不相同。能做一张优质的HE切片并不难，难的是做好所 有的切片。一个细小的环节出现问题，便会影响以后的所有步骤。 1、取材 ? ?取材的好坏，直接影响切片的质量。在一个规范的实验室，大部份的切片质量问题都是因为取材不好造成的。医生在取材时，首先要有一把锋利的取材刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以0.2 ～0.3cm为适，大块癌组织、脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些；淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织，如碰到不可避免的钙化组织，应与技术室讲明，在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时，应注意纤维及肌肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。小标本取材时要注意包埋纸的质量，尽可能选择象桃花纸、包茶叶纸等透水性好的纸张，包时不要双层、多层或折叠层数太多，也不要把过多的组织放在一起，影响脱水液的浸透。特别要注意新鲜组织取材，组织容易粘在包埋盒壁上，导致固定、脱水不佳。如果有可能，应选择剖开固定24小时后再取材。2 . 固定? ?固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加了组织的韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的5倍以上。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。最常用的固定液为10％福尔马林（甲醛）。福尔马林渗透性强，固定均匀，组织收缩小，但经酒精脱水后收缩较大。甲醛不能使白蛋白和核蛋白沉淀。甲醛通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。由于10％福尔马林受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入水分的影响，浓度容易被降低，导致组织固定不足；而高浓度的福尔马林，降低了对组织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。所以可以适当的增加福尔马林的浓度，以12％左右为佳。? ?pH7.0中性缓冲福尔马林对大多数抗原有很好的保存作用，而非中性缓冲福尔马林略差，通过大量实验证明，二者有差异，但并不十分明显，通过对抗原修复液、检测系统和修复方法的不同选择，可以缩小二者的差异。由于HE染色时细胞核的最佳着色点pH为3.5～4.5,中性福尔马林对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰。而病理诊断，主要还是以HE切片为主，就常规HE规范化而言，用酸性福尔马林比中性福尔马林要好，每95毫升12％的福尔马林液内加入5毫升的冰醋酸。但从规范和全面角度出发，还是应该使用中性缓冲福尔马林。当然如果根据常规切片、免疫组织化学和分子生物学的需要不同选用二种或二种以上不同的固定液分开制片是最好的解决办法。骨髓应该选择用Bouin液固定24-48小时，如果脱钙不够，可用10%盐酸再脱2-4小时，然后流水冲洗4小时。送检来的大器官应及时切开固定，大标本取材后（2cm厚）固定时间需要6～12个小时，小标本一般需要3～6个小时；当室温低18℃时，应在37℃以下的温箱内加温4～6个小时。? ?目前，环保固定液大部份是醇性固定液，对免疫组化结果有一定的影响，乳腺癌诊治规范明确规定不能用醇性固定液，由于我们的诊断标准都是根据10%中性缓冲福尔马林制定的，因此，我们应该慎用。3. 水洗? ?固定后应该水洗（10～20分钟），这一步通常被很多人所忽视，固定后不水洗，容易造成脱片和染色不鲜艳。也不利于蜡块内抗原的长期保存。4 .脱水? ?所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入，这一过程称为脱水。脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明。一般我们总认为脱水主要跟高浓度酒精有关，而忽视了与低浓度的酒精关系，其实75-80%浓