腺病毒介导的CTF基因在大鼠脊髓表达的实验研究.pdfVIP

目 录 中文摘要………………………………………………………………………1 英文摘要………………………………………………………………………4 研究论文腺病毒介导的CNTF基因在大鼠脊髓表达的实验研究 —】L—．’一 目U舌………………………………………………………………………8 材料与方法………………………………………………………………8 结果……………………………………………………………………14 附图…………………………．…………………………………………16 附表……………………………………………………………………25 讨{：f}：……………………………………………………………………26 结{仑……………………………………………………………………30 参考文献………………………………………………………………30 综述睫状神经营养因子研究进展…………………………………………33 致谢…………………………………………………………………………．．46 个人简历……………………………………………………………………．．47 中文摘要 毒介导的CNTF基因在大鼠脊髓表达的实验研究 摘 要 {ii的：睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic 一种可以促进多种神经元分化和存活，阻止神经元退变并保护神经元免受 中提取获得，因其能维持副交感神经节的存活并对睫状节神经元具有营养 作用而得名。CNTF最突出的作用是维持中枢和周围运动神经元的生物活 性，可以促进多种神经元的存活和分化，抑制神经元受损后的退变。正常 大鼠的脊髓可以表达少量的CNTF，且损伤后在中枢及周围神经损伤局部 会发生暂时性的表达上调，但其难以达到对抗神经损伤的水平。随着分子 生物学和基因工程技术的快速发展，利用复制缺陷型重组腺病毒 以期得到稳定持久的表达已成为神经损伤修复领域新的研究方向。本实验 的复制缺陷型腺病毒(ADO)分别导入大鼠脊髓腰膨大中，观察腺病毒介 导的外源性CNqlF基因在大鼠脊髓的表达水平，以探讨这一基因治疗新途 径。 三组当中。其中正常对照组(A组)42只，正常饲养不予处理；实验对 照组(B组)42只，导入不携带外源基因的重组腺病毒载体AdO；实验 腹腔注射10％水合氯醛麻醉，麻醉成功后将大鼠固定于立体定位仪上，切 取长约2cm后正中纵切口，逐层切开并分离椎旁肌肉显露T13椎板及棘 突，仔细咬除T13椎板后明胶海绵轻微压迫止血。微量注射器迅速吸取 中文摘要 止血，生理盐水冲洗后局部应用抗生素，关闭伤口。三组大鼠在B、C组 注射腺病毒后2天、7天、2周、4周、6周、8周、1O周时取材。将同 一时间点不同组别的wistar大鼠(6只)其中3只经多聚甲醛灌注后取出 脊髓腰膨大节段。另外3只大鼠在麻醉后不进行灌注直接取出脊髓腰膨大 节段，冻存于--70℃冰箱中留备RT-PCR实验之用。分别对三组大鼠不同 时间点的脊髓灌注标本进行409m连续振动切片，进行CNTF免疫组化实 验，计数脊髓前角CNTF阳性细胞数目。对冻存标本进行RT-PCR实验， CNTFmRNA的相对表达量。所测数据使用SPSS17．0统计软件处理，以 i士s表示，首先对三组数据进行方差齐性检验，若方差齐同则应用LSD．t 检验进行同一时间点组间两两比较，方差不齐采用Kruskal．WillsH检验， P0．05为差异有统计学意义。 结果： I CNTF基因在大鼠脊髓中的表达趋势 脊髓切片CNTF免疫组化检测显示A组(正常对照组)组内不同时 不具有随时间变化的趋势；B组(实验对照组)手术导入脊髓空白腺病毒 水平，在第2周及以后时间点与A组(正常对照组)比较无显著差异 后第2天CN7IF表达量增加，表达高峰同为第7天，此后逐渐下降，至第 8周时降至正常水平，且C组的CNTF表达量在第2天、7天、2周、4 周、6周时均高于同时间点B组和A组。统计分析显示：在手术导入腺 病毒后第2天、7天，三组两两比较均有显著差异(PO．05)；在第2周、 4周、6周，B、C组与A组(正常对照组)比较，C组与其有显著差异 2脊髓标本腺病毒PCR检测 利用腺病毒特异