第十四章免疫治疗和诊断精要.pptVIP

第十五章 免疫学检测技术 一.抗原抗体反应的原理 二.抗原-抗体反应的特点 沉淀反应中抗原和抗体的关系 二.抗原-抗体反应的类型和检测方法 （一）凝集反应 妊娠反应（+） 妊娠反应（+） 凝集反应图解 （二）沉淀反应 单向免疫扩散(single radial immunodiffusion) 单向免疫扩散试验 2.免疫琼脂双向扩散原理 双向免疫扩散试验 3. 免疫电泳 （三）免疫标记技术 1.酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 酶联免疫吸附试验 1.酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 2.免疫印迹 检测HIV血清抗体： 免疫印迹 3.直接和间接免疫荧光 4.免疫胶体金技术 一.外周血单个核细胞的分离 梯度密度离心 三.淋巴细胞及其亚群分离 磁珠分离 流式细胞术 四.淋巴细胞功能测定 （二）B细胞功能测定 溶血空斑试验 总结 若需要得到淋巴细胞，将PBMC放入平皿，收集未吸附的细胞。 若要得到T细胞，可通过尼龙毛、密度梯度离心。 若要得到B细胞，可通过尼龙毛。 磁珠分离：通过磁珠与抗CD4交联、与细胞悬液反应、磁场吸引得到CD4T细胞。 （一）T细胞功能测定 （1）增殖试验: 用有丝分裂素(植物血凝素PHA，刀豆蛋白ConA等)激活T细胞，引起细胞增殖。?（2） 细胞毒试验???? 常用51Cr释放法测定细胞毒效应。 将51Cr(Na251CrO4)标记的靶细胞加待检效应细胞共同孵育4-16小时，用γ射线测量仪检测细胞培养上清液51Cr的放射活性，判断效应细胞杀伤靶细胞的功能。 1.增殖试验:用B Cell有丝分裂素(小鼠:LPS，人:含SPA的葡萄球菌)刺激细胞增殖，观察方法与T cell增殖试验相同。?2.检测抗体水平或抗体形成细胞。（溶血空斑试验）??? 溶血空斑试验用于检验抗体形成细胞,通常用sRbc(绵羊红细胞),免疫小鼠后5-7天,取小鼠脾细胞与sRbc混入软琼脂中,注入瓶内再加一定量补体,在37摄氏度温室内孵育一定时间,即可在琼脂瓶中出现溶血空斑,每一空斑代表一个抗体形成细胞。?? * * 第一节 抗原或抗体的体外检测 第二节 免疫细胞及功能的检测 抗原与抗体发生结合反应的物质基础是抗原的表位与抗体的抗原结合部位之间的结构互补，二者相互结合。 在经典的凝集试验和沉淀反应中，有盐离子存在时，多分子发生聚合，如分子比例适当则出现肉眼可见反应。 1.特异性： 一种抗原一般只与由它刺激所产生的抗体结合，这是抗原抗体结合反应的专一性，即特异性。 2.可逆性： 抗原与抗体的结合是表面的结合，因此在一定条件下是可逆的。 3.可见性： 在一定浓度范围内，抗原抗体的比例调节到最合适时，才能出现可见的反应。 （一）凝集反应 细菌、红细胞等颗粒抗原与相应抗体结合后形成凝集团块的反应，称为凝集反应。 1.直接凝集 细菌、红细胞等颗粒抗原与相应抗体结合后形成凝集团块的反应。 玻片凝集——定性测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定 试管凝集——用于定量测抗体，如用于定量测抗体的肥达试验。 2.间接凝集 将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒物凝集的现象，如妊娠反应。 （绒毛膜促性腺激素，HCG） 血清白蛋白、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现白色沉淀的反应，叫沉淀反应。 用含有适当浓度Ab的琼脂板按一定距离打孔，将不同稀释度的Ag依次加入孔中，Ag向孔外扩散， Ag与琼脂中的Ab比例合适时，即形成沉淀环。 沉淀环直径与Ag浓度呈正比。测量沉淀环直径，即可从标准曲线，获知待检Ag含量。 将抗原与其相应抗体放在琼脂平板中的邻近孔内，使它们相互扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，即出现乳白色的沉淀线，该实验便称为免疫琼脂双向扩散。 该实验可用于：对抗原或抗体进行定性分析。目前较少用。 待检物先进行电泳，分离蛋白(待检物)，然后作双扩散，用已知Ab与分离的蛋白作用，Ab在不同位置与相应Ag形成沉淀线。 ????? 此方法可应用于Ag分析。 免疫标记是用荧光素、酶或放射性核素等标记物标记抗原或抗体，进行的抗原抗体反应，是目前最广泛的免疫学检测技术。 基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，如聚苯乙烯微量板表面，加入待检样品和酶标记抗体。抗原抗体反应后，用洗涤法将液相中游离成分洗除。加入酶底物，使形成有色产物。 间接法：用于检测特异抗体。用已知抗原包被作为固相，加入待测血清标本，再加