第十一章遗传重组精要.pptVIP

总之，在野生型大肠杆菌中，遗传重组需要RecA蛋白、RecBCD酶、单链DNA结合蛋白（SSB蛋白）、DNA聚合酶Ⅰ、DNA解旋酶、DNA连接酶以及RuvA蛋白、RuvB蛋白、RuvC蛋白或RecG蛋白。遗传学分析表明，recA-突变使大肠杆菌细胞内遗传重组频率降低106倍；当recA基因正常时，recBCD-突变使重组突变频率降低102倍，这说明RecBCD途径是正常细胞中遗传重组的主要途径。在野生型大肠杆菌中，99%的双链断裂重组需要RecBCD酶的参加。如果recBCD发生突变，重组可以通过另外两个效率较低的途径，即RecE和RecF进行的。但所有重组途径都需要RecA蛋白。 返回 第四节 酿酒酵母的同源重组 减数分裂重组 （meiotic recombination） 有丝分裂重组 (mitotic recombination) 减数分裂重组（meiotic recombination）和有丝分裂重组（mitotic recombination）有某些共同特征： （1）它们的同源重组都是由双链断裂（DSB）所启动； （2）参与减数分裂重组和有丝分裂重组的蛋白质基本上相同，但可能也有一些特异性蛋白。 参与重组的蛋白质主要有RAD50、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、MRE11、XRS2等，它们共同称为RAD52组。RAD52组的基因发生突变，则酵母细胞内不能进行同源重组（包括减数分裂重组和有丝分裂重组），而且变得对离子辐射如X-射线（引起双链断裂）和DNA链交联剂较为敏感。酵母中的RAD51在同源重组中的作用类似于大肠杆菌中的RecA蛋白，也是与单链DNA结合后，促进与另一个同源双链DNA的配对和链交换反应。在这个过程中可能还需要其他蛋白，如RAD50、RAD52、RAD54、RAD55和RAD57等的参与。但酵母细胞中哪些蛋白质参与异源双链迁移和Holliday连接体的切割，目前都尚不清楚。 减数分裂重组（meiotic recombination） 通过对从正在进行减数分裂的酵母细胞中提取的DNA所做的遗传和物理分析，表明在减数分裂过程中产生双链断裂，而且常出现在重组热点区。进一步的研究表明，双链断裂会引起单链尾巴的形成。电泳分析结果显示有2个Holliday 结构，而且己经证明，SPO11是不一种内切酶，在减数分裂重组过程中双链断裂的形成中起作用。 在酵母rad50S突变型细胞中，SPO11可以正常地产生双链结构，但对断裂的DNA不能进行修复，因此在减数分裂时会积累这些断裂的DNA分子。断裂的DNA分子可以通过琼脂糖电泳而确定。对第3染色体上的DNA断裂部分进行分析表明，双链断裂分布在整个染色体上。然而，断裂的位置是随机的，在开放阅读框架和启动子发生断裂的频率最高。据统计，在每次减数分裂中，平均产生石灰00个双链断裂（包括所有染色体上发生的双链断裂）。 有丝分裂重组(mitotic recombination) 有丝分裂重组也是由双链断裂所诱导的。外界因子和酵母细胞内部因子都可以造成双链断裂。我们知道，酵母交配型MATa和MATα之间可以发生转换，这种转换也是一种体细胞内的双链断裂同源重组，其中的双链断裂是在酵母细胞内HO内切酶作用下而产生的。HO内切酶引起Y-Z1交界处发生双链断裂后，Y区域就被降解（哪种酶降解这一区域还不清楚），一直进行到Ya 和Yα都相同的部分并与其中的互补链配对。再以供体3‘-末端就先后侵入供体座位（沉默座位）的同源部分并与其中的互补链配对。再以供体DNA为模板复制Y区域，形成Holliday连接体，然后通过拆分，产生新的MAT座位，而供体座位的序列保持不变。 返回 第五节 同源重组的应用 利用基因敲除（knock-out）技术进行基因功能分析，进而研究目的基因与表型性状间的关系，是研究动物、植物及微生物基因功能的一种非常有用的遗传操作方法。该方法的基本原理就是通过同源重组，即同源双交换方法，用失活的、无功能的突变基因取代基因组中野生型等位基因。进行实验操作时，要注意下面几点要求：第一首先需要克隆目的基因及其两侧的DNA序列；第二是通过插入抗性基因或DNA缺失，对克隆的目的基因进行体外遗传改造，使克隆的目的基因失活；第三是将经体外改造失落的目的基因引入到受体