电泳技术资料.ppt

10 电泳技术 Electrophoresis 10-1基本概念与背景 带电颗粒在电场中向电荷方向相反的电极移动的现象称为电泳(electrophoresis，EP) 电泳技术发展史 1809年俄国物理学家Рейсе 首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1909年Michaelis 首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH 的溶液在U 形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、?1-、?2-、?-、?-球蛋白5个主要成分。 由于他的突出贡献，他于1948年荣获诺贝尔奖金。 1948年Wieland 和Fischer 重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。 从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum 用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。 20世纪50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。 1959年Raymond 和Weintraub 利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。 60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。 30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即”电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即”Last Check”。 凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。 最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。 蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。 电泳技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。 目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中必不可少的手段。 电泳装置 电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。 电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。 电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。 垂直板式电泳 垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。 电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm × 14 cm，厚度为1mm～2 mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。 水平式电泳 水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。 由于pH 值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲可以保持待分离物的带电性质的稳定。 泳动率及其影响因素 带电颗粒在单位电场中泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)，可用下式： ? U = ?/E = （d/t）/ （ V/l ） ? 式中 U(也可以用m表示)：泳动度[cm2／(V·s)]；z／：颗粒泳动速度(cm／s)；E：电场强度(V／cm)；l：支持物的有效长度(cm)；V：实际电压(V)；d：颗粒泳动的距离；t：通电时间(s或min)。 被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： ?F = EQ ?式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位降；Q为被分离物所带净电荷。 根据Stoke定律，一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力)F’为： F’= 6?r?? 式中 ?为介质黏度；r：分子半径；?：分子移动速度。 ?当平衡时：F：F’， 即F = EQ = 6?r?? ；U = Q/ 6?r? U = Q/ 6?r? 由上式可见泳动度与球形分子半径、介质黏度、颗粒所带电荷有关 泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗