醋酸铵盐析法与DNA修复技术在福尔马林固定石蜡包埋组织DNA多态性分析中应用研究.pdf

Il㈣Y17㈧6嬲 目 录 一、摘要 中文论著摘要……………………………………………………………l 英文论著摘要……………………………………………………………4 二、英文缩略语…………………………………………………………………8 三、论文 前‘言日U舌 ………………………………………………………………………9………………………………………………………………………9 材料与方法………………………………………………………………10 实验结果…………………………………………………………………15 讨论 ………………………………………………………………………22 结论………………………………………………………………………28 四、本研究创新性的自我评价………………………………………………29 五、参考文献…………………………………………………………………30 六、附录 综述………………………………………………………………………32 致谢………………………………………………………………………46 个人简介…………………………………………………………………47 ·中文论著摘要· 醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡 包埋组织DNA多态性分析中应用的研究 刖 舌 福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin．fixedand tissue， paraffin．embedded FFPET)因其能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本，因此在临床 病理检验、法医病理学鉴定和医学科学研究过程中常被用到。这一处理过程虽然 能够使DNA免受内源性核酸酶的破坏，但是甲醛不仅会导致DNA链的断裂和降 解、DNA发生脱嘌呤以及DNA。蛋白质的交联，造成被固定组织DNA质量的改 变，而且其在模板DNA中的残存也严重影响着PCR扩增。 研究表明，影响FFPETDNA提取的因素有很多。如固定液的种类、固定时 间、切片厚度、切片存储时间以及不同的提取处理方法等均可影响FFPET提取 DNA的质量，从而影响其基因分型。通过优化蛋白酶消化条件、增加循环次数或 采用巢式PCR等，虽然可以提高扩增产物量或扩增特异性，但并未明显改善其检 tandem nucleotide repeat)系统或SNP(singlepolymorphism)系统，虽然提高了对 降解DNA检材的分型成功率，但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡 峰、伪峰等问题。此外miniSTR系统扩增片段长度不可能无限的减小(基本在50～ 的位点数较多等缺点，也限制了其在实际检案中的应用。 本研究基于法医学检案的实际需要，结合前人的研究成果，通过对醋酸铵盐 析法进行改进，并结合PCR前修复技术提高模板DNA质量，以期为法医学实际 检案中FFPETDNA的STR分型提供一种新的方法。 材料与方法 医科大学法医病理学教研室提供。 2、经10％中性福尔马林溶液固定ld、3d、5d和7d后，进行石蜡包埋，常规 切片备检。 盐析法影响因素进行探讨，并将其与酚／氯仿法、Chelex．100法进行比较，同时探 讨法医学可以实现成功分型的最小FFPET检材量。 4、对改良醋酸铵盐析法所提基因组DNA采用修复酶进行模板DNA的修复。 结 果 1、不同脱蜡方法提取基因组DNA的PCR．PAGE结果显示未脱蜡和脱蜡均可 得到清晰谱带；但是从谱带亮度上看95℃水浴脱蜡谱带最亮，65℃水浴脱蜡次之， 后依次为二甲苯脱蜡、微波脱蜡、不脱蜡。 2、不同消化缓冲液消化提取DNA的PCR．PAGE结果显示0．5％Tween20消 化谱带最亮，1％TritonX-100消化次之，后依次为0．5％SDS消化，2％CTAB消化。 3、不同浓度醋酸铵溶液沉淀所得基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果显示三 种浓度醋酸铵溶液提取的DNA量无显著性差异。PCR．PAGE结果显示三种浓度醋 酸铵溶液提取的基因组DNA扩增产物均可得到清晰谱带，谱带