第六章基因的转移与重组体的筛选和鉴定资料.pptVIP

作业 1 农杆菌介导的转化方法的原理及优点。 2 基因枪法的一般步骤。 此法的基本原理是，将包裹着DNA的金粒或钨粒，通过基因枪(gunpowder)、氦气 (helium gas)或电击(electric discharge)等技术来获得足够的加速度，射入完整的植株、组织外植体(tissue explants)、愈伤组织或细胞悬液。 生物弹击法的操作对象可以是完整的细胞或组织，突破了基因转移的物种界限，也不必制备原生质体，实验步骤比较简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和培养转基因植物的最有效的手段之一 * * 第六章　基因的转移与重组体的　　　　筛选和鉴定 一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起 单酶切、双酶切 第一节 DNA的体外重组 DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。 （一） 直接连接 T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ -OH -OH -P -P P- P- HO- HO- 5’ 3’ -OH -P P- HO- 5’ 3’ 二、平末端（blunt end）的连接 （1）同聚加尾法 （二） 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 ① 原理： 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 ② 加尾－碱基互补 ④缺点： ③优点： 能把任何片段连接起来 操作繁琐； 外源片段难以回收； 同聚物尾巴影响外源基因表达。 非酶切位点 （2）衔接物（linker）连接 Linker： 用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸 GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker： （二） 人工加尾形成 “粘性末端” （1）多核苷酸激酶处理 （2）T4连接酶连接 （3）限制性内切酶消化 （4）目的片段与载体连接 （二） 人工加尾形成 “粘性末端” （3）DNA接头 （adapter）连接法 ① adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列） Blunt-ended DNA 5’p-GATCCCGG-OH3’ 3’HO-GGCC-p5’ BamHI adapter P- -P 5‘p-GATCCCGG- GGCC- -CCGG -GGCCCTAG-P5’ 接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接 ② 优点： 连上后就能用。 ③ 缺点： 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 ④ 防止自我连接 5‘p-GATCCCGG- GGCC- CCGG GGCCCTAG-p5’ Blunt-ended DNA 5’p-GATCCCGG-3’ GGCC-p5’ BamHI adapter P- -P 5’HO-GATCCCGG- GGCC CCGG -GGCCCTAG-OH5’ 5’HO-GATCCCGG3’ GGCC-OH5’ nick缺口 nick缺口 HO- -OH CIP处理 T4 ligase 虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化 三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点 符合载体的多克隆位点； （1）设计原则 （2）带酶切位点的引物的结构 3’端15～20bp与模板互补； 5’端内切酶识别序列＋保护碱基 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 带酶切位点的PCR产物 GCAGAATTC PCR产物 5’- -3’ CCTAGGCGC PCR产物 -5’ 3’- CGTCTTAAG GGATCCGCG EcoR I位点 BamH I位点 AATTC PCR产物 5’- -3’ CCTAG PCR产物 -5’ 3’- G G EcoR I BamH I 两头各有一个粘性末端！ A A dNTP T T dTTP Taq DNA聚合酶 载体 PCR产物 TA TA 三、PCR产物的连接 2. 与T载体直接连接 第二节 重组体导入受体细胞 一、重组DNA导入大肠杆菌 （一）转化（transformation） 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （三）转染（transfection） 受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。