分子生物学核酸分子杂交资料.ppt

分子杂交技术 --xxx Q:医生是如何快速准确地检测出安吉丽娜·朱莉携带BRCA-1突变基因？ 三、Western 印迹法(蛋白质杂交技术) 四、生物芯片 谢谢观赏 生物芯片简介 概念 生物芯片，又称DNA芯片或基因芯片，它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。 芯片种类 按固定分子： 基因芯片(Gene Chip) 蛋白质芯片(Protein Chip) 细胞（组织）芯片（Cell/tissue Chip） 根据用途 信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。 优点： ①微型化 ：平方厘米大小，实验所需试剂用量少 ②高通量：一次检测数万个分子 ③自动化 ④标准化 ： 传统方法检测众多基因要经历多次实 验，因而每次实验之间是存在系统误差的。 缺点： 在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不 同。 芯片特点 生物芯片的应用 ①基因表达水平的检测 ②基因诊断 ③药物筛选 ④个体化医疗 ⑤测序 ⑥生物信息学研究 芯片分析基本流程 ①芯片制备 ②样品制备 ③分子杂交 ④检测分析 载体的材料 玻璃片（最常用的材料） 聚丙烯酰胺板 金属片 硅片 基因芯片的制作方式 原位合成 直接点样 ①芯片制备 ②样品的制备 提取DNA或RNA，PCR或RT-PCR扩增，掺入荧光染料标记。 与Northern和Southern杂交的区别：样品标记而不是探针标记 ③杂交 过程类似于一般的杂交法。 样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。 与经典分子杂交的区别： 杂交时间短，30分钟内完成 可同时平行检测许多基因序列 影响杂交反应的因素： 盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构 1) 杂交 Apply sample 2) 冲洗 她通过基因检测得知自己本身携带BRCA-1突变基因，罹患乳腺癌及卵巢癌的风险巨大， 医生评估她患乳腺癌几率为87%，经过一些手术降低成5%。 主要内容： 一、分子杂交简介 二、核酸杂交技术 三、蛋白杂交技术 四、基因芯片 概念 凝胶电泳分离待测DNA、RNA或Pr并转移固定到结合物上，然后与探针/抗体杂交分析。 原理 碱基互补配对原则（核酸变性和复性）/抗原-抗体反应。 一、分子杂交简介 分类（常用分子杂交技术） 1969 ，In situ hybridization（ISH）：原位杂交 1975，Southern，Southern blotting: DNA印记 1977，Alwine，Northern blotting：RNA印记 1979，Towbin，Western blotting：蛋白质印记 二、核酸分子杂交技术 基本概念 DNA变性 DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）?。 DNA复性 DNA发生热变性后，经缓慢降温，例如放置室温逐渐冷却，解开的互补链之间对应的碱基对再形成氢键，恢复完整的双螺旋结构，称DNA热变性的复性。 核酸分子杂交 概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。 RNA DNA 复性 核酸探针 概念： 一小段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）。 探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。 探针的分类 根据标记物不同可分为放射性探针和非放射性探针两大类； 放射性标记物（ [α-*N]-dNTP ） 32P(14d)、35S(87d)、3H(12y)和125I(60d) 非放射性标记物 半抗原：生物素、地高辛 荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC） 根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，寡核苷酸探针等几类。 探针的标记方法: 放射性标记 ??①缺口平移法 ??②随机引物延伸 ??③5’?末端标记法 ??④3’-末端填充标记法  随机引物标记法 原理及过程：人工合成的6~8个核苷酸长的各种不同排列顺序的混合物，它们可以随机地互补到DNA探针的某一处，作为引物，在DNA聚合酶的作用下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应液中加入[α-32P]dATP时，即可