分子生物学研究法上资料.ppt

按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。 Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质与RNA分子分离，还能保证RNA的完整性。 由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。 纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0之间。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； OD260值=1，相当于单链DNA或RNA为40μg/mL，寡核苷酸为20μg/mL。 （四）宿主细胞 大肠杆菌 酵母 1、常用种类 2、导入方式 转化（transformation） 转染（transfection） 转导（transduction） 二、细菌转化与目标DNA分子的增殖 细菌转化（Transformation）: 一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的DNA。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学的处理，以增加它们获得DNA的能力。经历这种处理的细胞被称为感受态细胞（Competent Cell）。 常用细菌转化的方法1CaCl2法 将快速生长中的大肠杆菌置于经(0℃）预处理的低渗氯化钙(0.1mol/L)溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，外源DNA粘附在细胞表面。 42℃下做短暂热刺激，细胞吸收外源DNA。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，涂布于选择性培养基中分离转化子。 常用细菌转化的方法2电转化法 克隆的筛选和鉴定： 1、抗生素 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。 2、α-互补蓝白斑筛选法 实验室常用带有不同抗生素的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。 载体上：β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基 端（N端）146个氨基酸编码序列，在编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）； ?片段 宿主细胞：编码β-半乳糖苷酶C端序列 ?片段 宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。 X-gal 蓝色化合物 X-gal β-半乳糖苷酶 IPTG （LacZ基因 N端序列） LacZ基因 N端序列 LacZ酶 LacZ基因 N端序列 插入片段 （LacZ基因失活） 细菌转化与目标DNA分子的增殖的操作过程 第二节 DNA的基本操作技术 （Techniques for DNA Manipulation） 一、核酸的凝胶电泳 二、聚合酶链式反应 三、实时定量PCR 四、基因组DNA文库的构建 一、核酸的凝胶电泳 核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对DNA或RNA进行分离。因此，可用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术的技术基础。 凝胶电泳的基本原理 将一带电荷的分子放置到电场中，会以一定的速度移向适当的电极（电泳）。这种分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。电场强度越大，带点分子净电荷越多，迁移速率越快，分子越慢。 在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质（琼脂糖or 聚丙烯酰胺凝胶），电泳迁移率与分子的摩擦系数成反比。 摩擦系数是分子大小、极性、介质粘度等的函数。因此，在同一凝胶中、一定电场强度下，可根据分子大小的不同、构型的差异以及所带电荷的多寡，将分子混合物中的各种成分彼此分开。 生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈负离子化状态。同时，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同大小的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。 常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。 琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来的。将琼脂糖粉