第六章人工染色体资料.ppt

质粒 受体细胞 结构 插入片断 举例 E. coli 环状 〈 8kb pUC18/19 , T-载体pGEM- 3z等 λ噬菌体 E. coli 线状 9 - 24kb EMBL系列，λgt系列 丝状噬菌体及噬菌粒 E. coli 环状 〈 10 kb M13mp系列 粘粒载体 E. coli 环状 35- 45kb pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome) E. coli 环状 ≈300 kb Pel oBAC系列 PAC (P1-derived Artificial chromosome) E. coli 环状 100 - 2000 kb PCYPAC1 YAC (Yeast Artificial chromosome ) 酵母细胞 线性染色体 100 - 1000 kb MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 哺乳类细胞 线性染色体 〉 1000 kb 病毒载体 动物细胞 环状 SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 穿梭载体 动物细胞 和细菌 环状 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 载体的种类和特征 练习题 已知基因a的表达产物是一种酶A，已知这种酶A具有几个保守位点，请考虑如何从基因组中扩增基因a，并实现体外高效表达？需要使用的质粒载体有哪些？酶切位点如何选择？ 保守区2 保守区1 保守区3 酶A * 第六章 人工染色体 生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生化反应系列，受多基因或基因簇的控制，与成百至上万千碱基的DNA片段相关。 复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也涉及到大片段DNA的研究。 因此，提高载体的容纳量一直是克隆载体的重要发展方向之一。 随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的日益深入，对可插入大片段DNA的克隆载体——人工染色体的研究取得了迅速的发展 所谓人工染色体——是一类能在生物细胞中独立“稳定存在和遗传的人工重组DNA分子”。 酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC，1000kb） 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC，300kb ） 哺乳类人工染色体（MAC） P1衍生人工染色体 现正在研究的人工染色体 总结 一、YAC的基本序列元件 酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS） 酵母染色体的着丝粒顺序（CEN） 酵母染色体的端粒顺序（TEL） 第一节 YAC——酵母人工染色体 YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。 正常酵母人工染色体含有： *四膜虫端粒（tel） 定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，形成稳定的结构 酵母自主复制序列（ARS) 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必需的信号。 酵母着丝点 (CEN) 有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。 pYAC4 ：酵母第四条染色体的着丝粒。 ?YAC 载体的选择标记 主要采用营养缺陷型基因 TRP 1：色氨酸生物合成基因缺陷型URA 3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型LEU 2：亮氨酸合成基因缺陷型 SUP 4：赭石突变抑制基因 作用方式：YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。 由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。 二、克隆策略 YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段DNA，克隆进酵母载体DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体 三、YAC克隆系统的特点 1、YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程（200～500kb，甚至1000kb） 2、用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC变成一个大的YAC 3、酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境 四、 YAC克隆系统的缺点 首先，在YAC载体的插入片段会出现缺失 （deleti