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第四节 核酸的研究方法 一、核酸的分离、提纯和定量测定 （一）DNA的分离 （二）RNA的分离 关键在于防止RNase对RNA的降解。 （三）核酸含量的测定法 二、核酸的凝胶电泳 凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。 (一)琼脂糖凝胶电泳： （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） (一)限制性内切酶（restriction endonuclease） 五、DNA聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 定义： 体外快速扩增DNA的方法。DNA双链经高温变性，分开的单连DNA分别与寡聚核苷酸引物互补结合（退火），在聚合酶、dNTP和Mg2+的存在下，DNA聚合酶催化DNA链的合成，如此经变性- 退火- 合成三步反复循环，使所需要的DNA片段得到特异的扩增。 六、核酸的核苷酸序列测定 1. DNA的化学法测序（ MaxamGilbert 法） * 用苯酚、氯仿-异戊醇或蛋白酶K等去除蛋白质。 用乙醇沉淀DNA。 用RNase去除RNA。 DNA与碱性蛋白结合形成核蛋白（DNP）。 DNP溶于1M NaCl, 不溶于0.14M NaCl。 常用 酸性胍盐 /苯酚 / 氯仿法提取RNA。 mRNA的提取可用 oligo(dT)n 亲和层析法。 定糖法 紫外吸收法 核酸 浓硫酸 或过氯酸 Pi + 钼酸 磷钼酸 钼蓝 还原剂 （?660nm处比色） 地衣酚法定量测定RNA 二苯胺法定量测定DNA 定磷法 核酸分子因带电量、分子量、构象不同，泳动速度不同。 带电量越大，分子量越小，泳动速度越快。 泳动速度：超螺旋DNA 线性DNA 开环DNA 以琼脂糖为支持物。常用水平板电泳。 适于分离0.2 ~ 20Kb 的DNA片段。 凝胶浓度0.5 ~ 3%（常用1%胶分离DNA ）。 应用： 分离纯化DNA。 确定DNA 分子片段的大小和含量。 研究DNA 分子的构象。 侧视 俯视 样品槽模板（梳子） 凝胶托盘 凝胶 凝胶托盘 样品槽 Fig. 4-43-1 Illustration of horizontal electrophoresis. Fig. 4-43-2 Illustration of horizontal electrophoresis. 2000 1000 750 500 250 100 1 2 3 4 5 6 Fig.4-44 Restriction analysis of recombinants 1. p1/ PstI 2. p2 / PstI 3. p3/ PstI 4. DL2000 Marker 5. p1/ HincII 6. p2 /EcoRV 以聚丙烯酰胺为 支持物。常用垂直板电泳。 适于分离10 ~ 1000bp 的DNA片段和RNA。 凝胶浓度3~ 20%。 Fig. 4-45 Vertical Electrophoresis. 三、DNA克隆 (DNA Cloning) Clones: The descendants of a single cell. Cloning: The production of large numbers of identical DNA molecules, cells or organisms, from a single ancestral DNA molecule, cells or organism. 克隆： 从单一祖先DNA分子、细胞或有机体产生大量的同一DNA分子群、细胞群和有机体群的过程。 Schematic illustration of DNA cloning 1.定义： 2.特点： 专一性强（识别序列具特殊的回文结构） 切割后的DNA片段具粘末端或平末端 是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切断DNA双链的核酸内切酶。 3. 命名： 例： E Co R I 属名第一个字母 种名头两个字母 菌株 酶的编号 4. 应用： DNA体外重组的重要工具酶 制作DNA限制酶图谱 指DNA限制酶切片段沿DNA或DNA片段的依次排列。 Fig.4-47 Restriction map of the plasmid pBR322. （二）克隆载体 （Cloning Vectors） plasmids Bacteriophages ( 例: ?) bacterial artificial chromosomes (BACs) Yeast Artificial Chromosomes (YACs) 15,000 bp 40,000 - 5