植物基因克隆技术进展.pptVIP

植物基因克隆技术策略 一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径： 正向遗传学途径：正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等； 反向遗传学途径。反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等； 随着DNA 测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。 1 功能克隆 功能克隆（Functional Cloning）就是从蛋白质的功能着手进行基因克隆，是人类采用的第一个克隆基因的策略。 其基本步骤为：根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，分离纯化蛋白并测定出部分氨基酸序列 根据遗传密码推测其可能的编码序列，设计相应的核苷酸探针，杂交筛选cDNA 文库或基因组文库，最终获得编码区或全基因序列 或者使用该蛋白质特异的抗体，筛选表达载体构建的cDNA文库，通过抗原抗体反应寻找特异的克隆，最后对选中的克隆测序，获得目的基因的序列 1 功能克隆 关键技术： 用这一策略克隆基因的关键在于必须首先分离出一个纯的蛋白，测定出其一部分氨基酸序列或得到相应抗体； 其次要构建cDNA 文库或基因组文库； 然后要对文库进行杂交筛选 例如与苯丙酮尿症相关的酪氨酸羟化酶基因，与镰刀型细胞贫血症相关的珠蛋白基因，都是用这种方法取得成功例子。 这种方法有其局限性，即只适用于克隆那些蛋白质产物及其相应功能都已清楚的基因，无法去克隆蛋白质产物还不清楚的基因。 1 功能克隆 随着生命科学研究的深入，以及蛋白质双向电泳技术和蛋白质测序技术的日趋成熟与完善，各种差异表达的蛋白质将被大量分离纯化，必将给功能克隆提供更好的条件，使之得到更加广泛的应用，功能克隆将会继续发挥其重要作用。 2 定位克隆 定位克隆技术（positional cloning）又叫图位克隆（map-based cloning），是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，适合于克隆编码产物未知的基因 原理：首先利用分子标记技术对目的基因进行精确定位，用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因组文库（BAC/YAC）,用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群 通过染色体步行（chromosome walking）逐步逼近候选区域 或通过染色体登陆（chromosome landing）的方法获得含有目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆 或以大片段克隆作探针筛选cDNA 文库; 从而将目标基因确定在一个较小的DNA 片段上并进行序列分析 最终通过遗传转化和功能互补试验分析，鉴定目的基因。 2 定位克隆 植物中运用图位克隆技术，从拟南芥、水稻、番茄、大麦、小麦、甜菜、马铃薯等植物中分离了许多重要的基因。如番茄的Mi 基因，Hero 基因；马铃薯的Gpa2 基因，拟南芥的RPW8 基因、PBS1基因、Rpp13基因和水稻的Pita、Xa1、Pib等基因。 近年来张启发等利用图位克隆的方法相继分离克隆出同时控制水稻株高、抽穗期和每穗粒数的基因Ghd7和控制水稻籼粳不育和广亲和性状的主效基因S5，以及调控水稻开花时间、影响其生长周期的基因RID1，在水稻功能基因组研究领域取得重大突破。 2 定位克隆 定位克隆理论上适用于一切基因，但由于定位克隆依赖于高密度的分子标记连锁图谱，因此该技术对于基因组较小，重复序列少而且已经构建了高密度RFLP或RAPD等标记图谱的植物无疑是非常有效的，如拟南芥、水稻等模式植物。 但对于小麦、玉米等基因组大而且重复序列多，又难于构建高密度分子标记连锁图的植物来说，要相对困难得多。 对这类作物采用该方法分离克隆基因存在成本高、效率低、进展缓慢的缺点。 但随着比较基因组研究的兴起，利用同科异种植物间染色体的共线性进行比较作图，如以拟南芥、番茄和水稻为中介来克隆其他十字花科、茄科和禾本科植物的基因，将成为一个新的发展方向。 3 转座子标签法（transposon tagging） 转座子是可从染色体的一个位置转移到另一位置的DNA 片段，最早在玉米中发现的，在生物界中转座子是普遍存在的。 转座子标签技术克隆基因的基本原理是，利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相关表型突变的特点，以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子插入而功能失活的基因。如果某基因的突变是由于转座子插入而造成的，那么以转座子序列为探针就可从变异株的基因组中筛选出带有此转座子的部分基因，再以突变基因的部分序列作探针，即可从野生型文库中克隆出完整的基因。 3 转座子标签法 在植物中利用转座子的有玉米的Ac/Ds，En/Spm 和金鱼草的Tn3 等，其中应用最多的是Ac/Ds 双因子系统 利用转座子标记技术目前已克隆到