植物基因工程与作物育种.ppt

Bt基因的表达-western杂交分析 (引自 Tu et al 2000 Nature/Biotechnology 18: 1101-1104) cry1Ab toxin 10ng cry1Ab toxin 2ng NT 1 2 3 4 5 6 7 TT51-1 M (kDa) 66.0 46.0 30.0 60 kDa Western杂交 ELISA Kamle S, Ali S. Genetically modified crops: Detection strategies and biosafety issues. Gene 522 (2013) 123–132 3.3.外源基因表达的表型鉴定 3.3.1 选择标记的鉴定 转 hpt 基因植株 非转化对照植株 Hm浸泡筛选 明恢63/Bt 明恢63 control 3.3.2. 目标性状鉴定 Peter Hedden and Andrew L. Phillips(2000) References Hossein Azadi ，Peter Ho. Genetically modified and organic crops in developing countries: A review of options for food security. Biotechnology Advances 28 (2010) 160–168. Philippe Vain. Thirty years of plant transformation technology Development. Plant Biotechnology Journal, (2007) ,5 , pp. 000–000 * * * * * * 原理——在高压脉冲条件下，细胞膜出现 短暂的可逆性开放小孔，为外源物质提供 了通道，可以导入外源DNA分子。孔道的 形成的数量和大小与电场强度有关，关系 到摄入DNA的量。 1)、电激法介导的基因转化 优点：操作简单、基因转化效率高、特 别适于瞬间表达的研究 缺点：造成原生质体的损伤，使植板效 率低，且仪器也昂贵。 2)、显微注射法 该法在动物细胞的基因转化中应用的比较成熟。 它借助于显微注射仪，将外源DNA或mRNA通过机械方法直接注射到受体细胞。用于植物基因转化的植物样品有游离细胞、原生质体、分生组织和胚胎组织等多细胞结构。 使用显微注射仪把外源DNA溶液注入到子房或胚囊中,卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植物。 胚囊、子房注射法 Ovary-drip transformation Pollen-tube pathway method: DNA solution was applied to the cut styles. Ovary-drip method: DNA solution was applied to the ovaries with entirely decapitated styles ●植物的胚囊结构是八核胚囊，是一个拥有较大空隙的空腔，能够吸入一定的外源DNA溶液；　 ●卵细胞有一侧没有细胞壁，只有一层质膜，能够吸入外源DNA； ●正常的花粉管进入胚囊后也是在胚囊中破裂，释放出的雄配子DNA也在胚囊中； ●受精后的细胞能正常发育成胚及种子； ●外源DNA溶液注入胚囊后对卵细胞造成一个较大的渗透压，迫使外源DNA进入卵细胞； ●如将外源DNA注入子房中，通过花粉管进入胚珠的通道，能够使外源DNA从子房引入胚囊； ●注入的外源DNA可以是已重组构建的带目的基因及启动子的DNA，因此，导入卵细胞后可以整合到核DNA中并得到表达。 优点： （1）是一种纯粹的物理方法，适用于各种植物和各种材料，无局限性； （2）整个操作过程对受体细胞无药物等毒害，有利于转化细胞的生长发育； （3）转化细胞的培养过程无需特殊的选择系统。 缺点： 需要精细操作的技术以及低密度培养的基础，注射速度慢,效率低。 3）花粉管通道法 原理：将外源DNA片断在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。这一技术可用于任何开花植物。 特点：参与了被转化植物的生殖过程，直接操作于整体植株，避免了传统的基因枪法和土壤农杆菌法转化要求的组织培养技术，转化方法简单，易操作，但双子叶植物都可应用，育种时间较短，具有很强的适用性。 4）浸泡法介导基因转化 植物细胞能够不