疫苗级乳球菌表载体的构建及柔嫩艾美耳球虫ta4基因的表达.pdfVIP

中文摘要 { (为了保证表达载体的安全性，避免抗药性因子随着载体系统的使用，可 能在菌群中相互传递而发生扩散。疫苗级(食品级或非抗生素抗性)表达系 统的研究越来越为人们所关注。疫苗级表达系统的要求是宿主菌必须采用安 全的、特性清楚而稳定的微生物：载体采用非抗生素抗性选择标记：采用食 品级的诱导物。目前所构建的非抗生素抗性表达载体，大多是以互补型标记 作为选择标记，应用范围较窄，遗传操作复杂，增加了基因工程的烦琐性。 为了避免这些麻烦，非抗生素抗性显性标记成为改造疫苗级表达载体研究领 域的前沿和热点。厂1 为了构建疫苗级显性标记载体，本研究利用乳链菌肽(Nisin，一种由某 些乳球菌产生的高效、无毒的天然食品防腐剂)作为选择压力，以乳链菌肽 抗性作为显性选择标记来构建乳球菌疫苗级表达载体，来弥补现有载体的不 足。同时，组建基因工程乳球菌，为重组乳球菌表达外源基因的研究奠定基 础。 7Lac+)紧密连 利用乳链菌肽抗性菌株中乳链菌肽抗性和乳糖发酵(Nis 锁的原理，在含有乳链菌肽、乳糖和溴甲酚紫的选择培养基上，从新鲜的205 份牛奶样品中定向筛选塾壁苴然荭丝萤赫。／对筛选到的四株菌分析鉴定，结 果表明：四株菌均为革兰氏阳性菌，产乳酸，过氧化氢酶试验阴性；通过质 ZL2010、 粒的抽提和电泳，发现四株菌ZL2009、 ZL2024和ZL2030分别 含有1、7、5和3条厉粒带，特异性16SrRNAPCR扩增产物的旦蔓垒崖到测 lactis ’定结果表明这四株菌为乳酸乳球菌乳酸亚种(goctococcus subsp．1actis)。 以分离到的菌株ZL2010质粒DNA为模扳，根据乳链菌肽抗性基因(”sr) 序列设计了一对引物，用PCR技术扩增出大小为957bp的乳链菌肽抗性基 因编码区。通过常规的连接方法用其替换pMG36e载体上的红霉素抗性基因． 再用电穿孔法转化到乳酸乳球菌中，筛选鉴定后，获得以nsr基因为选择标 记的非抗生素抗性的乳球菌表达载体，命名为pMG36n。／， 以柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因为例来检测所构建表达载体的性质。根 ^ 据已发表的球虫TA4基因序列设计特异性引物，并在引物的两端分别加上 I和Sac Kpn I作为插入的酶切位点，将TA4基因克隆到表达载体pMG36n 中，电穿7L法转化乳酸乳球菌，获得有TA4抗原活性的乳酸乳球菌工程菌， 对该菌的表达产物用SDS—PAGE检测，结果表明表达产物的蛋白分子量为 25KDa，与预期结果相同。 以刚出壳的健康雏鸡为试验对象，用上述表达球虫TA4基因的工程乳球 菌口服雏鸡10天，之后进行人工感染球虫试验，一周后宰杀，通过试验鸡 体重、粪便中卵囊数、盲肠病变记分、盲肠卵囊数和抗球虫指数等指标进行 60．1 评价，结果抗球虫指数为1 2，达到良好水平。 、 关 键 词 疫 =}丑 乳 球 菌 达 载 体 臻篮 TA』， 镰因 连 够 一k{l 一