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Enzyme Engineering 酶工程 第二章 酶催化的基础知识 酶作用的底物有单底物、双底物和多底物之分： 单底物：异构酶、水解酶（水浓度几乎不变）、裂合酶（单向单底物反应） 双底物：氧化还原酶、转移酶和裂合酶的合成方向 A+B＝P+Q 根据反应机制：序列机制和乒乓机制 酶作用动力学的研究进展： 1、20世纪初，用数学原理和质量作用定律解释酶反应的进程 2、1902年，Henri和Brown提出酶促反应中有酶-底物配合物ES的生成 3、1913年，Michaelis和Menten用平衡态推导出单底物酶促反应方程 4、1925年，Briggs和Haldane对酶反应动力学引入了稳态的概念。 5、 20世60年代初用平衡态概念解释多底物酶促反应 一、活性中间复合物学说 单底物酶促反应： 活性中间复合物学说：酶促反应分两步，首先是底物S与酶E结合生成中间复合物ES，然后ES分解成P，并释放E。 Henri1902年研究蔗糖酶水解蔗糖的反应，得到一条曲线： 当[ S]KS时,即[ S]很大时 v=vmax 该反应速率达到最大值。 当[ S] KS时, 则 v=vmax* [ S]/ KS 即对于某一反应，当酶浓度不变时，由于vmax和 KS都是常数，所以v与[ S]成正比。 米氏方程的修订 Briggs和Haldane: 鉴于许多酶的催化效率高，即 对米氏方程的假设3进行了修正，提出了“拟稳态”假设。 由于反应体系中底物浓度远大于酶浓度，ES分解后的酶又与底物结合，并维持ES浓度不变，即ES的浓度不随时间的而变化，这就是拟稳态。 “米氏方程”和“米氏方程修订”的特点： 1.快速平衡 拟稳态 2.Ks Km 三、“米氏方程”的意义： 1.米氏常数Km的意义 当酶促反应速度等于最大反应速度一半时，此时底物浓度，就是该酶的米氏常数。 米氏常数的意义 2、提供了酶促反应级数的判断依据 当[ S]Km,一般[ S]10 Km,酶促反应为零级反应，此时可以进行酶活力或酶的浓度。 当[ S]Km,一般[ S]0.01 Km,酶促反应为一级反应，此时可以进行底物浓度（往往是低浓度的物质，痕量）。 3 最大反应速度Vmax的意义 米氏方程中Vmax虽不是特定常数，但当酶浓度一定，且[S] [EO] 时，对酶的特定底物而言， Vmax是定值，故在判定酶抑制类型时， Vmax的变化情况可以作为判断依据之一。 4、酶反应速度常数 K2的意义 K2酶的转换数（TN）：每个酶分子在单位时间内催化底物转变为产物的次数。 单底物反应中， K2就是酶的催化常数Kcat 寡聚体酶反应中， 酶的催化常数Kcat就是酶浓度乘以酶的活性部位数。 k2或kcat是酶催化效率高低的依据 5.提供了高效性和专一性的综合判断依据kcat /Km kcat /Km k1 催化效率 酶与底物有效碰撞的速度 专一性常数 酶与底物互补结合的特性。 四、米氏常数的求法 Km、Vmax值的双倒数图求法的实验设计： 教材p231的实验五“尿酶Km简易测定” 1.在同一条件下，以同一浓度的尿酶催化不同浓度的尿素分解， 2.尿素的终浓度 3.对应的酶促反应速度v Km、Vmax值的其它求法： 1.Eadie－Hofstee作图 将双倒数形式的方程式两边同乘Vo、 Vmax 2.Hanes作图 将双倒数形式的方程式两边同乘[So] （1）酶的“最适”反应温度 在较低温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大；超过一定温度后，反应速度下降。酶反应速度达到最大值时的温度称酶反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的温度下测酶活力；以温度为横坐标，反应速度为纵坐标作图，可得到一条温度-酶活力曲线，从中可求得最适温度。 实验的设计：一系列变化的温度保留一定时间， 与保留时间有一定关系 例1：酸性磷酸酯酶 取8支试管，自行编号制表，0号为空白。各管加入1.2 mmol/L NPP(对-硝基苯磷酸酯)1.0 mL，另取8支试管加入酶液2 mL。酶与底物对应在10℃，20℃，30℃，35℃，40℃，50℃，60℃，70℃恒温水浴槽保温2min。酶液预热时间不要超过2min，否则酶易失活，特别是在温度较高时。。 各管加入酶液1.0mL，精确反应15min后，加入0.3 mol/L