第二次实验PCR.pptVIP

一、实验目的： 二、实验原理： 三、实验材料及仪器： 四、实验步骤： 五、注意事项： * Molecular Diagnostics PCR技术的发展： 1986年首次公开，1988年商品化。 1993年荣获诺贝尔化学奖。 PCR技术的重要应用： （1）法医学鉴定：只需一根毛发或一点唾液就足以鉴定 和分析。 （2）临床医学：传染病的快速诊断，大大缩短诊断时间。 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。 1 2 3 PCR的实质： 一种体外酶促反应，利用DNA聚合酶的催化 活性，在体外扩增特异性的核酸序列，实现 对核酸在体外的复制。 PCR的基本原理： 模板DNA 引物 4种脱氧核苷酸 DNA 聚合酶 在体外合成已知序列的DNA片段。 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-55?C 1、变性 使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链DNA 2、退火 引物和其互补的模板在局部形成杂交链。 3、延伸 通过Taq DNA聚合酶使4种单核苷酸从引物的3`端开始掺入，沿模板从5`向3`端方向延伸，合成与模板DNA的互补链。 以上3步为一个循环，每一循环的产物可作为下一个循环的模板，反复进行这一循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增，循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经20次循环扩增后可达106。 PCR循环第一步：加热变性 双链DNA解链为单链 PCR循环第二步：引物与靶序列退火 50-60℃引物与单链DNA互补结合 引物 引物 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ PCR循环第三步：引物延伸 72℃延伸，以引物3’为起点合成完整互补双链。 Taq DNA Polymerase 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 第 1 个 PCR 循环完成后—— 得到两个拷贝的靶序列 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 DNA模板（自提DNA） PCR仪，台式离心机，电泳仪，电泳槽 移液枪，枪头，反应管 引物一对（RM1 F，RM1 R） 反应缓冲液（dNTP，Taq酶） 灭菌双蒸水 引物的准备 1、根据靶序列设计特异性成对引物 引物设计软件;Blast引物特异性。 2、送生物公司合成引物 3、按要求稀释引物 模板DNA的准备 1、根据标本的不同提取。 （如组织、细胞、全血等） 2、测模板浓度及纯度。 模板浓度及纯度的测定： （检测波长：260nm，280nm） 只需按下“dsDNA”键，即可进行检测， 自动计算并显示260/280比值， 以及样品浓度。 Eppendorf BioPhotometer Plus 核酸蛋白测定仪（BioPhotometer Plus） ? 根据要求向一只比色皿中加入 DNA 标准样液或不含 DNA 的空白液做对照， 将该比色皿放 入比色皿槽，按下 Standard 键或 Blank 键；待屏幕上显示标准样的 A 260 值或 0.000?A 字样时，取出对照比色皿； ? 4 、 ? 放入加有样品的比色皿，按下 Sample 键，显示屏将会显示测定结果 1、空白管（比色皿）测定：按“BLANK”键。 2、稀释管测定:按“Dilution”,输入DNA体积和稀释液体积即可。确定后插入待测管按“Sample”键，即可。 PCR反应的准备 1、PCR反应液的制备： （1）＜1ug DNA （2）引物：RM1 F 1ul RM1 R 1ul （3）12.5ul反应缓冲液 （4）DH2O 补足总反应体积25ul. 充分混匀，放入PCR仪中反应。 2、反应条件的摸索及程序的确定 94 ℃，预变性3分钟； 94 ℃，变性30秒 55 ℃，退火30秒 30个循环 72 ℃，延伸1分钟 72 ℃，延伸5分钟 3、将反应管从PCR仪中取出，放入冰上。 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物 所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染 所有PCR试剂中用的水都应该是最高质量的双蒸水 所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意然后再分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性 PCR管和枪头都一次性使用 * * *