实验二培养基的制备及灭菌要点.pptVIP

实验三 培养基的制备及灭菌 一 、实验目的 1、了解培养基制备原理，学习并掌握培养基制备方法。 2、掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和方法。 二、基本原理 （一）培养基的制备原理 培养基是微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。 从营养角度分析： ?营养：碳源、氮源、生长因子、水分和无机盐等； ?适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力； ?一定的氧化还原电位； ?合适的渗透压。 （二）灭菌原理 1、干热灭菌原理 干热是指相对湿度在20％以下的高热。干热消毒灭菌是由空气导热，传热效果较慢。一般繁殖体在干热80－100℃中经1小时可以杀死，芽孢需160－170℃经2小时方可杀死。 2、干热灭菌操作步骤 （1）在移液管尾部塞上少许棉花，然后用报纸条 包好；用报纸条包好干燥的培养皿。 （2）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，注 意不要摆的太挤，以免妨碍气流流通。 （3）开启电源，设定温度为160℃ ~170℃ ，保持 此温度1~2小时。 （4）切断电源，待温度降至70℃以下时，打开箱 门，取出灭菌物品。 2、湿热灭菌原理－高压蒸汽灭菌 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 高压蒸汽灭菌操作步骤 （1）加水： 直接加水至锅内底部隔板以下1/3处。有加水口者由加水口加入至止水线处。 （2）装锅： 把需灭菌的器物放入锅内，关严锅盖。 （3）接通热源： 将锅盖上排气阀关闭，同时打开底部排气阀。待见有大量水汽排出时，维持3～5min，关上底部排气阀。 高压蒸汽灭菌操作步骤 （4）升压、升温： 关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸汽不断增多，压力计和温度计的指针上升，当压力达到 1.05 kg/cm2（温度为 121℃）即灭菌开始，这时维持在1.05 kg/cm2，20～30min。 除含糖培养基用0.56 kg/cm2压力外，一般都用 1.05 kg/cm2压力。 （5）切断电源： 达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到0时，打开排气阀。 高压蒸汽灭菌操作步骤 （6）揭开锅盖，取出灭菌物，排掉锅内剩余水。 （7）待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无 菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。 注意事项！ （1）灭菌物不要装得太满，否则灭菌 不彻底。 （2）盖上锅盖，以两两对称方式同时旋紧螺栓，勿使 漏气。 （3）排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降， 温度没下降会使培养基翻腾冲到棉塞处，既损失 培养基又沾污了棉塞。 三、实验器材 1、药品：琼脂，10％HCL（各组自配），10%NaOH（各组自配），牛肉膏蛋白胨培养基、高氏I号培养基和马铃薯葡萄糖（蔗糖）琼脂培养基（PDA）的配方药品。 2、材料：刻度1000mL塘瓷量杯，天平，试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，药匙，pH试纸，棉花，报纸，麻绳，标签，培养皿等。 3、设备：高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。 四、实验方法及步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的制备 1、称 量 按培养基配方比例依次准确地称取所需药品放入烧杯中。 牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。 称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。 3、调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6，反之，则用1mol/LHCl进行调节。 注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。 对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行 。 4、过 滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。 2、溶 解 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 如果配制固体培养基，将称好的琼脂