07第七章遗传03解析.pptVIP

第四节 基因工程 Gene Engineering 一、基因工程定义 基因工程：指通过人工方法将目的基因与载体DNA分子连接起来，然后导入受体细胞，从而使受体细胞获得新的遗传性状的一种崭新的育种措施。 二、基因工程基本操作 1、目的基因的取得 2、优良载体的选择 3、目的基因与载体DNA体外重组 4、重组载体导入受体细胞 5、重组子的筛选与鉴定 6、工程菌的大批量培养 限制性内切酶 常见的限制性内切酶及其酶切位点 1、在生产多肽类药物、疫苗中的应用干扰素、白细胞介素、胰岛素 2、改造传统工业发酵菌株利用淀粉酶基因改造酒精酵母 3、动植物特性的基因工程改良转Bt抗虫棉、转基因猪、牛、鸡 4、在环境保护中的作用分解石油的工程菌、基因工程杀虫剂 第五节 菌种的衰退、复壮和保藏 一、菌种的衰退及其防治 2、衰退的防止 （1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法 二、菌种的复壮 2、复壮的方法 1）纯种分离 通过纯种分离,可把退化菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化的方法有平板稀释法、单细胞或单孢子分离法等。 2）通过寄主体进行复壮----对于寄生性的退化菌株,可回接到相应寄主体上,以恢复或 提高其寄 生性能。例如,根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科寄主植物上,令 其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。 3）淘汰已衰退的个体----例如对“5406”放线菌的分生孢子,采用-10～-30℃处理5～7天,其死亡率达80%,在抗低温的存活个体中,留下了未退化的健壮个体。 三、菌种的保藏 2、菌种保藏方法 1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一般不超过3个月,到时必须进行移接传代,再放回冰箱。 2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上,加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期1～2年 4）真空冷冻干燥法---是目前较理想的一种方法。在低于-15℃下,快速将细胞冻结, 并保持细胞完整,然后在真空中使水分升华致干。在此环境中,微生物的生长和代谢都暂时停止,不易发生变异,故可长时间保存,一般为5～10年,最多可达15年之久。此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条件,使微生物可以保存较长时间,但手续较麻烦,需要一定的设备。 3、菌种保藏中心 ----工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)---轻工业部食品发酵工业科学研究所, 南京(ID),真菌;卫生部药品生物制品检定所,北京(NICPBP),细菌；中国医学科学院病毒研究所,北京(IV),病毒。/----抗菌素菌种保藏管理中心(CACC)---中国医学科学院抗菌素研究所北京(IA)；四川抗菌素工业研究所,成都(SIA),新抗菌素菌种;华北制药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),生产用抗菌素菌种。----兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)农业部兽医药品监察所,北京(CIVBP) 。 美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。 第七章 微生物遗传变异与育种 基因克隆流程 1.工具酶:限制性核酸内切酶、DNA连接酶、逆转录酶、DNA聚合酶等 2.目标基因 3.载体 4.宿主 质粒 供体DNA-目标基因 大肠杆菌细胞 转化细胞抗性菌落 目标基因的克隆与鉴定 已知基因的克隆 PCR:从基因组扩增出目标基因 RT-PCR:反转录PCR从mRNA中获得目标基因 未知基因的克隆 基因文库(gene library):基因文库指用一个基因供体的DNA构建的所有克隆的混合群体，通常是将同一来源的不同DNA片段插入一种载体，从而便于纯化、储存和分析；如果这些DNA来自基因组，所构成的文库叫做基因组文库(genomic library)。 cDNA文库(cDNA library)：如果这些DNA是由mRNA逆转录产生的cDNA，所构成的文库叫做cDNA文库(cDNA library)。 DNA聚合酶和聚合酶链式反应 DNA聚合酶(DNA polymerase)与DNA合成：在有一条DNA单链为模板和一段寡核苷酸为引