L4312_3_a_2_5创新.ppt

影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA的纯度； DNA的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA的分子结构； 溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的pH值。 单酶切反应体系A(20μl) ddH2O 补至20μl DNA Xμl(0.1-4μg) 10×buffer 2μl 内切酶 1-5U/μgDNA 多酶切反应体系 多酶具有相同反应条件和反应温度 同一反应混合物 多酶在不同缓冲液中具有不同程度的活性，反应条件差别太大 需低浓度盐的酶消化 加盐，需高浓度盐的酶消化 连接反应体系(50μl) 酶 DNA连接酶 T4噬菌体 DNA连接酶 10×buffer 5μl 5μl DNA量 1μg 1μg 酶量 10U 1U 能量 100mM NAD 500mM ATP 温度 10-25 12-30 时间 2-16 1-16 可能的实验结果 实验的常见问题、关键问题及难点 微量操作、酶切体系的合理性、酶切是否完全、连接体系的合理性、连接效率 实验七大肠杆菌感受态细胞的制备及转化  实验目的 学习与掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞；掌握外源质粒DNA转入受体菌的方法以及转化体的筛选技术。 学习内容 感受态细胞的制备及重组DNA的转化、重组子的筛选。 学习要求 课前预习、课后总结；认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析。 实验操作步骤 细菌的培养 → 菌体的收集→菌体的处理 →转化体系的配制 → 平板培养→ 重组体的检测（具体实验操作步骤参照实验讲义进行）。 实验材料与仪器设备 实验六所制备样品无菌超净台、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、制冰机、冰箱、水浴锅、灭菌离心管等 可能的实验结果 实验的常见问题、关键问题及难点 感受态细胞的质量、转化质粒DNA的浓度和质量 蓝白斑筛选 可能的实验结果 小白斑的电泳鉴定结果 注：图的上半部分为提取质粒后直接电泳结果，下半部分为进行了双酶切后的电泳结果 实验八学生设计实验  实验目的 通过学生自己设计、自己完成实验,把前面学到的理论、技术融会贯通地用到实际课题中去，使理论与实践更好的结合，提高学生创新性思维和独立分析、解决问题的综合能力。 学习要求 要求学生用所学知识和技能，利用实验室现有设备条件和材料试剂等，自己收集相关资料，设计一个综合性的、探索性的实验，在学生讨论、实验教师点评的基础上、进行实验方案修改，并优出几个最适合实施的设计方案，将全班兴趣一致的同学分成一组，共同在实验室中开展相关实验。 实验九(选做)植物总RNA的提取及其电泳鉴定  实验目的 了解和掌握RNA制备及常用鉴定方法。 学习内容 用RNA提取试剂盒提取植物总RNA；分光光度法检测RNA纯度；琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测RNA 学习要求 课前预习、课后总结；认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析。 实验操作步骤 研磨裂解材料 → 离心过柱→再次离心过柱 →洗涤 → 溶解RNA → 分光光度法检测及电泳检测（具体实验操作步骤参照实验讲义进行）。 实验材料与仪器设备 学生自行采集新鲜植物材料紫外分光光度计、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、冰箱、抽干机、灭菌离心管、RNA提取试剂盒等 可能的实验结果 实验的常见问题、关键问题及难点 RNA产量较低、RNA不纯、RNase污染 中南林业科技大学生理生化实验室 分子生物学实验技术 主讲人: 吴 顺 主要教学参考书 精编分子生物学实验指南(第四版),F.M.奥斯伯等主编,马学军等译校,科学出版社 分子物学实验技术,郝福英等编著,北京大学出版社 分子物学实验指导,刘进元等编著,清华大学出版社 PCR-based marker-assisted selection in rice breeding,Kangle Zheng et al, International Rice Research Institute 目 录 序号 实验内容 学时 实验一 实验准备及实验规范训练 8 实验二 CTAB法快速提取植物总DNA及纯度鉴定 4 实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 8 实验四 碱裂解法小量制备质粒DNA 4 实验五 PCR基因扩增及DNA片段的回收 6 实验六 质粒DNA和目的片段的限制性酶切及连接） 10 实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 8 实验八 学生设计实验及实施（平时与科研结合做） 实验九 植物总RNA的提取及其电泳鉴定（选做） 实验一 实验准备及实验规范训练 实验准备 器皿清洗、试剂配制、灭菌分装、取用保存 仪器的使用 离心机、移液器、电泳设备、成像系统等的使用 实验室的安全和卫生 分组与实验操作 实验报告与成绩评定 高压灭菌锅 无菌超净台 恒温振荡培养箱 高速离心机