7细胞培养技术解析.pptVIP

体外培养：模拟体内生长条件，体外使组织、细胞或器官生存、生长并维持结构和功能的技术。 原代培养（primary culture） ：从有机体得到的组织或细胞在体外进行第一次培养。 传代培养（passage culture）：当培养的细胞增殖达一定密度后，则需要将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个容器中扩大培养。 细胞培养 细胞系（cell line）：是从原代培养物经传代培养后得来的多种细胞类型所组成一群不均一的细胞，可以长期连续传代。 细胞株 （cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 S2细胞系（果蝇胚胎） Sf21细胞系（草地贪夜蛾卵巢） Hela细胞系（人宫颈癌） 1907年1951年?1962年?1967年 1975年?1975年? Harrison创立体外组织培养法。Earle等开发了能促进动物细胞体外培养的培养基。悬浮培养小鼠肾细胞(BHK)，动物细胞培养技术的起步。DEAE-Sephadex A 50 微载体培养动物细胞获得成功。 激素代替血清使垂体细胞株生长，无血清培养技术。小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合产生分泌抗体的杂交瘤细胞。 表14-2? 动物细胞培养技术的发展? 动物细胞培养技术的进展 细胞培养的应用： 1. . 生物医学研究 （在细胞生物学、分子生物学、遗传学、药理学、免疫学、细胞工程、老年学、肿瘤学和病毒学以及临床各学科领域中有广泛的应用） 2. 生物制品的生产(如制备单克隆抗体、疫苗） 3. 检测有毒物质并判断其强弱 4. 转基因动物的培养 5. 器官移植培养 6. 筛选抗癌药物 体外培养细胞的生存条件 1、无菌环境 2、温度： 正常培养温度在体温±0.5℃，培养细胞对低温的耐受性比对高温的强，细胞代谢与温度呈正比，4 oC时可存活。 3、水的质量 4、渗透压 5、pH条件：细胞耐酸耐碱强 6、气体条件： O2参与三羧酸循环可为细胞提供能量。CO2主要与维持培养液的pH值。 7、营养条件 细胞所需营养从培养液中获取。 合成培养基成分由氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等组成。培养物不同培养基不同。目前有TC199、RPMI 1640、Eagle‘s MEM、Grace等商品培养基。还需补充部分天然培养基，如人和动物血清、血浆和胎汁等。通常10～20％的小牛血清。 无血清培养基是由基础培养基和替代血清的补充因子组成如：生长因子、激素，促贴附物、转铁蛋白等活性物质。 8、培养基质 就是细胞附着底物：玻璃和塑料培养瓶(皿) 。一些不易贴壁的细胞，可以事先在培养瓶、皿底面涂上一层鼠尾胶，小牛皮胶或多聚赖氨酸等，以促进细胞贴壁生长。 细胞培养的基本技术 一、 培养用品的清洗与消毒 消毒灭菌： (1)湿热灭菌：布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液可用此法消毒灭菌。 (2)干热灭菌： 160℃，1小时。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法。 (3) 滤过除菌：孔径0.22?m微孔滤膜滤器。 (4) 紫外线消毒 (5) 消毒剂及抗生素 消毒剂：75% 酒精常用于皮肤和瓶皿开口部位的消毒；0.1% 新洁尔灭是目前最常用的消毒剂，可以对器械、皮肤、操作面进行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空气消毒；来苏儿可用于地面消毒；、过氧乙酸消毒能力很强，在0.5%的浓度下，10min 就可将芽孢菌杀死。 抗生素为青霉素、链霉素和庆大霉素等。 二、无菌操作的基本要领和要求 1、培养前的准备 灭菌物品在工作前移入超净工作台内。 2、超净工作台的消毒 工作台面擦拭后，紫外线灯管直接照射20～30 分钟。使用时打开风机。培养用液和培养细胞不能放在紫外线下直接照射。 3、洗手和着装 洗手后用0.2％新洁尔灭擦洗。无菌服，无菌帽和口罩。 4、火焰消毒 操作时点燃酒精灯，安装吸管橡皮头、开瓶塞、使用吸管等都要近火焰处进行或经过火焰烧灼。 5、无菌培养操作 进行细胞培养操作时，不能用手触及器皿的无菌部分，如已接触，要更换或用火焰烧灼触及部。培养液等不要过早开瓶，不要长时间直立暴露开口，以免增加污染机会。吸取不同用液时，使用不同的吸管，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。 三、细胞培养的方法 原代培养 单细胞培养法：所有组织中都含有一定量的细胞间质（纤维、基质等），妨碍细胞生长。用酶消化后，能除去间质，使组织松散，容易分离成单个细胞或较小的细胞