优质课血红蛋白的提取和分离资料.ppt

* 1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 一、基础知识 3、提取分离方法 凝胶色谱法 电泳法 （一） 凝胶色谱法（分配色谱法） 2.凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据蛋白质相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 1.概念： 3.凝胶色谱法的原理 ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢; ②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。 ③依据的特性是：蛋白质相对分子量的大小。 4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 （二）缓冲溶液 1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外界的 酸和碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混 合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响， 维持PH基本不变。 2.作用: 思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4/Na2HPO4 H2CO3/NaHCO3 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性) 磷酸缓冲液 3.缓冲溶液的配制: 其目的是: （三） 电泳： 1.概念： 带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正 电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 二、实验操作 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 1.样品处理： （一）蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤: 去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化. 1、采集血样 2、低速短时间离心（离心速度过高和时间过长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 3、吸出血浆：上层透明的黄色血浆。 4、生理盐水洗涤：下层暗红色的红细胞+五倍体积的0.9％的NaCl溶液洗涤，搅拌10min 5、低速短时间离心： 6、重复3、4、5步骤三次 直至上清液中不再呈现黄色：红细胞洗涤干净（红细胞洗涤干净的标志）。 ①目的: ②操作： 洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。 (2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积（使红细胞吸水胀破）， 加40％体积的甲苯 （溶解脂质物质，也有利于红细胞的胀破和血红蛋白的释放） 置于磁力搅拌器搅拌10min（加速红细胞破裂） 红细胞破裂，释放出血红蛋白 (3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次： 第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）； 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 第4层（最下层）：其他杂质的暗红色沉淀层（暗红色）。 ③分离： 滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层， 分液漏斗中静置：分出下层的红色透明液体。 (4)透 析（粗分离）： ①过程： 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h ②目的： 除去样品中分子量较小的杂质 或用于更换样品的缓冲液。 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL ③原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内 2.凝胶色谱操作: （1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端磨平。 ②底塞的制作： 打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端（注意：导致液体残留，蛋白质分离不彻底）。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B