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第二章 分子克隆载体 Vectors 第一节 分子克隆载体的特点 分子克隆载体是一类可供外源 DNA插入并携带重组DNA分子 进入适当宿主细胞的DNA分子 质 粒 载 体 克 隆 的 一 般 步 骤 see movie 分子克隆载体的功能:  为外源基因提供进入受体细胞的转移 能力  为外源基因提供在受体细胞的复制能 力或整合能力  为外源基因提供在受体细胞中的扩增 和表达能力 一、发展概况  第一阶段 （1977年前）：天然质粒和 重组质粒的利用 如pSC101, ColE1, pCR, pBR313  第二阶段：增大载体容量，建立多克 隆位点区和新的遗传标记基因  第三阶段：进一步完善载体的功能以 满足基因工程克隆中的不同要求 二、载体的特点  至少有一个复制起点，因而至少可在一 种生物体中有效复制，稳定遗传  至少应有一个限制酶识别位点，以供外 源DNA插入  至少应有一个遗传标记基因，以指示载 体或重组DNA分子是否进入宿主细胞  具有较小的分子量和较高的拷贝数  具有对受体细胞的可转移性, 提高载体 导入受体细胞的效率 pBR322 is an early example of a widely used, purpose-built cloning vector 三、遗传标记基因 标记基因的作用：  指示外源DNA分子 （载体或重组分子） 是否进入宿主细胞  指示外源DNA分子是否插入载体分子形 成了重组子 标记基因的种类：  抗性标记基因  营养标记基因  生化标记基因 常用的遗传标记基因 r r  四环素抗性基因（Tc Tet ） 抑菌剂，Tetracycline 可结合在核糖 体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制 核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合 成，细胞停止生长。 四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋 白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素 分子进入细菌细胞。 r  氨苄青霉素抗性基因（Amp ） 杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞 膜上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰 细胞分裂，杀死细胞。 r Amp 抗性基因编码一种分泌到细菌 细胞周间质的酶，催化β— 内酰胺环的水 解，使氨苄青霉素失活。 r  氯霉素抗性基因（Cm ） 抑菌剂，Chlorophenicol可结合在核糖 体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。 r Cm 基因编码氯霉素乙酰转移酶，使 氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不 能结合在核糖体上。 r r  卡那霉素(Kan )、 新霉素(Neo )、G418 r 抗性基因(G418 ) 杀 菌 剂 ， Kanamycin ， Neomycin 和 G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗 生素，可结合在核糖体上，导致mRNA 发生错读。 r 来自转座子Tn5和Tn903 的Kan 抗性基 因均可使这类抗生素磷酸化，使