蛋白激酶nemo样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

中 国 医 学 科 学 院 学 报 ＡＣＴＡＡＣＡＤＥＭＩＡＥＭＥＤＩＣＩＮＡＥＳＩＮＩＣＡＥ ·论　著 · 蛋白激酶 Ｎｅｍｏ样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 程筱雯，梁俊波，缪时英，王琳芳 中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 １００００５ 通信作者：王琳芳　电话：０１０电子邮件：ｗａｎｇｌｉｎｆａｎｇ＠ｉｍｉｃａｍｓａｃｃｎ 　　摘要：目的　构建含有蛋白激酶Ｎｅｍｏ样激酶 （ＮＬＫ）的重组腺病毒载体。方法　采用ＲＴＰＣＲ方法在人胚肾细胞 系ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中扩增ＮＬＫ基因及其突变体Ｋ１５５Ｍ、Ｔ２８６Ｖ和Ｃ４２５Ｙ，同时在目的基因的Ｃ端添加便于蛋白表达检测 的ＦＬＡＧｔａｇ，经与载体 ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶ连接、转化、筛选、鉴定后，将 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达正确的重组过渡质粒 ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶＮＬＫ及其突变体再经酶切、电转入ＢＪ５１８３感受态细胞 （已包含腺病毒骨架质粒ｐＡｄＥａｓｙ１）同源重组， 并筛选、鉴定、扩增。通过ＰａｃＩ酶切后，以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚氯仿异戊醇法回收酶切产物，用高效 低毒高稳定性的ＦｕＧＥＮＥＨＤ转染试剂替代传统的ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００转染低代数的ＨＥＫ２９３Ａ包装细胞，进行病毒包装。 包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞ＨＣＴ１１６，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测以确认ＮＬＫ及其突变体蛋白的表达。结果　经ＰＣＲ、 测序及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证实，成功构建了携带ＮＬＫ基因及其突变体的腺病毒载体，ＰＣＲ及限制性内切酶酶切鉴定重组 过渡质粒ｐＡｄＴｒａｃｋＣＭＶＮＬＫ及其突变体与腺病毒骨架质粒ｐＡｄＥａｓｙ１同源重组成功，重组表达克隆转染 ＨＥＫ２９３Ａ细 胞获得病毒原液，扩增后感染结直肠癌细胞ＨＣＴ１１６能正确表达ＮＬＫ蛋白及其突变体蛋白。结论　成功制备 ＮＬＫ基因 及其突变体重组腺病毒，可进一步用于ＮＬＫ生理功能的研究。 关键词：蛋白激酶Ｎｅｍｏ样激酶；重组腺病毒载体；同源重组 中图分类号：Ｑ３１　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１０００５０３Ｘ（２０１１）０６０６３２０６ ＤＯＩ：１０３８８１／ｊｉｓｓｎ１０００５０３Ｘ２０１１０６０１０ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｅｍｏｌｉｋｅＫｉｎａｓｅＧｅｎｅ ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒ ＣＨＥＮＧＸｉａｏｗｅｎ，ＬＩＡＮＧＪｕｎｂｏ，ＭＩＡＯＳｈｉｙｉｎｇ，ＷＡＮＧＬｉｎｆａｎｇ ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ， ＣＡＭＳａｎｄＰＵＭＣ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００００５，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＷＡＮＧＬｉｎｆａｎｇ　Ｔｅｌ：０１０Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｌｉｎｆａｎｇ＠ｉｍｉｃａｍｓａｃｃｎ ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｎｅｍｏｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ（ＮＬＫ）ｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃ ｔｏｒＭｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅＡｄＥａｓｙｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒＵｓｉｎｇｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（