微生物细胞破碎解读.ppt

4、植物细胞壁 构架物质：纤维素 基质：果胶 典型结构： 胞间层 初生壁 次生壁 非极性R基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸 小分子氨基酸静电引力可以渗透过细胞壁中，通过氢键、范德华力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构。 第三节 破碎率的测定及破碎技术  的研究方向 * 破碎技术研究方向-与下游工程相结合举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶 * （ inclusion bodies IBs) 第四节 包涵体的纯化 胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。 胞内表达： 胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收集上清→纯化。 胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。 不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。 * 生物分离过程的一般流程 本节内容 * 外源蛋白在大肠杆菌中的积累 蛋白 产物占菌体总蛋白 外源蛋白的积累 人胰岛素 50% 形成包涵体 β-丙酰胺酶 20% 在细胞间区 γ-人体干扰素 25% 形成包涵体 凝乳酶原 形成包涵体 牛生长激素 30% 形成包涵体 β-内酰胺酶 形成间区包涵体 人胰岛素原 5%~26% 形成包涵体 * 包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。 包涵体的形成的原因？ 蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀； 蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；分子内部二硫键的错误连接导致沉淀； 表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态； 蛋白质自身不稳定。 包涵体的构成 * 2）珠磨法 bead mill 细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。 WSK卧式高效全能珠磨机 * 3）超声波破碎（Ultrasonication) 利用超声波振荡器发射的15-25kHz超声波处理细胞悬浮液。 在超声波作用下液体发生空化作用,液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力,引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 * JY92-II D超声波 细胞粉碎机 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种类型，一般破碎效果后者比前者好。 破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。 操作过程产生大量的热，操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。 * 适用范围 杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低。 由于对冷却的要求相当苛刻，且大规模操作中声能传递和散热有困难，不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。 * 技术 原理 效果 成本 举例 匀浆法(孔型) 须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎 剧烈 适中 细胞悬浮液大规模处理 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠或铁珠捣碎 剧烈 便宜 细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理 超声波法 用超声波的空穴作用使细胞破碎 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模处理 研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 不同机械破碎方法的比较 * 二、非机械破碎方法 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing） 其中酶法和化学法溶胞应用最广。 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing） 其中酶法和化学法溶胞应用最广。 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing） * 1、酶解（酶溶法 Enymatic lysis) 酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。 1）外加酶法 常用的溶酶 溶菌酶、 β-1，3-葡聚糖酶、 β-1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等 * 外加酶法 酶解法的特点是专一性强，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-