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遺伝子工学 配列特異的DNA鎖切断 　制限酵素 DNA鎖連結 　DNAリガーゼ 3末端への塩基付加 　ターミナルデオキシリボヌクレオチジル 　トランスフェラーゼ（TdT） DNA鎖複製 　Taqポリメラーゼ（Thermus aquaticus） 逆転写 　AMV (Avian Myeloblastosis Virus)-RT 　MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus)-RT 遺伝子操作の手法 制限酵素 二本鎖DNAの特定の塩基配列を認識して切断する酵素 EcoRI ＧＡＡＴＴＣ ＣＴＴＡＡＧ Escherichia coli由来 BamHI ＧＧＡＴＣＣ ＣＣＴＡＧＧ Bacillus amyloliquefaciens由来 HindIII ＡＡＧＣＴＴ ＴＴＣＧＡＡ Haemophilus influenzae由来 付着末端（cohesive end）が残る HhaI ＧＣＧＣ ＣＧＣＧ Haemophilus haemolyticus由来 KpnI ＧＧＴＡＣＣ ＣＣＡＴＧＧ Klebsiella pneumoniae由来 NotI ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＣＧＣＣＧＧＣＧ Nocardia otitidis-caviarum由来 XbaI ＴＣＴＡＧＡ ＡＧＡＴＣＴ Xanthomonas badrii由来 付着末端（cohesive end）が残る DraI ＴＴＴＡＡＡ ＡＡＡＴＴＴ Deinococcus radiophilus由来 SmaI ＣＣＣＧＧＧ ＧＧＧＣＣＣ Serratia marcescens由来 HincII ＧＴＣＧＡＣ ＣＡＧＣＴＧ ＧＴＴＡＡＣ ＣＡＡＴＴＧ Haemophilus influenzae由来 平滑末端（blunt end）が残る DNA分子の結合１ ＴＴＡＡ ＡＡＴＴ ＴＴＡＡ ＡＡＴＴ DNAリガーゼによる結合 DNAリガーゼによる結合 ＧＧＧＧ ＣＣＣＣ ＧＧＧＧ ＣＣＣＣ DNAリガーゼによる結合 DNA分子の結合２ ターミナルデオキシリボヌクレオチジル トランスフェラーゼ（TdT）による付加 dGTP dCTP 宿主?ベクター系 大腸菌 プラスミド（pUC系） λファージ コスミド 酵母 シャトルベクター（pUC?酵母ars1） 酵母人工染色体（YAC） 動物細胞 シャトルベクター（pUC?SV40） レトロウイルス（MMLV由来） 昆虫細胞 バキュロウイルス ベクター???目的遺伝子の運び手 　?宿主細胞内で安定に複製する 　?適当な制限酵素切断点を有する 　?薬剤耐性などのマーカーを有する シャトルベクター???細菌と真核生物双方で増殖できる 大腸菌系ベクタープラスミド pUC18 (2,686 bp) pBR322 (4,361 bp) X-gal ブルーセレクション β－ガラクトシダーゼ 非酵素的 二量体化 青色色素 遺伝子クローニング クローニング???ある生物から特定のDNAを取り出して増幅すること 　　制限酵素による切断　→　ベクターDNAに結合　→ 　　宿主細胞内で増幅　→　目的DNAを有する組換え体を選別 　クローン???目的の遺伝子を含む組換え体 　DNA供与体???クローニングのためDNAを取り出される生物 ファージベクターを利用したクローニング 　ファージDNAに目的DNAを挿入　→　パッケージング 　パッケージング???組換えDNAをファージ粒子に挿入すること 遺伝子ライブラリー（ジーンバンク） 　　制限酵素などで断片化された全ゲノムDNAを含むクローン クローニングできる遺伝子のサイズ プラスミド（pUC系） ～10 kb λファージベクター ～20 kb コスミド ～40 kb 酵母人工染色体 ～400 kb 塩基配列決定法 ジデオキシ法（サンガー法） 　　特定塩基のジデオキシリボヌクレオチドを取り込むとDNA合成が終結 　　　　　↓ 　　電気泳動でオリゴヌクレオチドの長さ（塩基数）を測定 　　　　　↓ 　　特定塩基までの塩基数から特定塩基の位置を決定 ATGCATGCATGCという配列のオリゴヌクレオチド 　　ddCTPを加えてDNA合成反応を行う 　　　↓ 　　ATGCATGCATGC 塩基数12 　　ATGCATGC 塩基数8 　　ATGC 塩基数4 　　　↓ 　　Cは4，8，12番目にある ハイブリッド形成による遺伝子解析 ハイブリダイゼーション（交雑） 　相補的な配列をもつ異種DNA同士で二本鎖を形成させること 　目的配列を有するDNAを蛍光あるいは放射標識しておけば， 　　目的の遺伝子を含む 　　　?プラスミドを保有するコロニー（コロニーハイブリダイゼーション）