HPCE毛细管电泳研究生课程教案.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Effect of pH on migration time * Effect of methanol concentration on migration time * CZE分离中药川乌和草乌中三种剧毒乌头碱 * 毛细管区带电泳分离中的有关因素 工作电压的选择 缓冲液的选择 缓冲液pH的选择 缓冲液的浓度选择 缓冲液中不同添加剂的选择 * 在一般情况下，毛细管的分离柱效随电压的增大而提高。当超过极点时，随着电压的增大焦尔热的产生加剧，柱效反而下降。极点的电压值视系统配置和分离组分的不同而不同。 工作电压的选择 * 毛细管温度的 选择 毛细管温度的有效控制对于检测结果的重现性来说是很重要的。温度稳定在 ±0.1℃是比较好的。检测操作过程中进样和迁移时间决定于溶液的粘度，而粘度的变化会严重影响检测结果。同时温度也会影响溶液的粘度，所以系统应使毛细管避免受环境温度变化的影响。常用的两种方法是液体恒温和高速气流。 * 毛细管温度的 选择 尽管毛细管恒温的主要目的是维持恒定的温度以散逸焦耳热，温度控制的可靠也可以作为 HPCE 一个优化分离的参数。温度的升高或降低能够改变粘度、EOF 和分析时间。 * 毛细管温度的 选择 * 缓冲溶液的选择对于任何形式的HPCE 的成动分离都是非常重要的。EOF 对于pH的改变很敏感，所以要求使用缓冲溶液以维持恒定的 pH。在HPCE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液： 〈1〉在所选的PH 范围内有较强缓冲能力； 〈2〉在检测波长处有低的紫外吸收； 〈3〉小的淌度以降低所产生的电流。 通常选用Tris 、borate Phosphate acetate 作缓冲液的较多，但要注意其pH 和浓度的控制。 缓冲溶液的选择 * 缓冲溶液pH的选择 pH 的选择三原则，即： 〈1〉缓冲溶液的pH必须比被分离物质的等电点高或低1个pH 单位，以便得到合适的电泳淌度。 〈2〉在条件许可的情况下尽可能采用酸性缓冲液，使得毛细管壁上的吸附和电渗流降低，提高毛细管涂层的寿命。 〈3〉在分离蛋白质中，蛋白质的等电点低于缓冲液pH时，极性放置应是+ → -，反之是 - → + 。 由于熔融石英毛细管化学稳定性较好，pH应用范围可以从 212，但是在实际应用时，通常要受到溶质的pH 稳定性所限。 * 缓冲溶液浓度的选择 在一般情况下，浓度增加被分离物质的迁移速度下降，有利于分离效果的提高，尤其是对某些特殊的分离。但随着缓冲溶液浓度的增大，粘度增加，电渗流和焦尔热增大，将给分离造成反作用，因此实际分离中必须对缓冲溶液做优化选择。 * 添加剂的选择 选择性，即溶质迁移的先后顺序，是由产生分离的机理所决定的，控制选择性能够提高分离度并获得确证分离的辅助性信息。由于不同方式的HPCE 的分理机理不同，因而其选择性也不同。 在CZE中，可以通过改变缓冲溶液的pH 或使用缓冲溶液添加剂，如表面活性剂来改变选择性。因此，在CZE 分离中选择一种合适的缓冲液添加剂是改善分离的极有效的方法。 * 不同的缓冲液添加剂 添加剂 功能 无机盐 改变蛋白质结构(选择性) 有机修饰剂(Methanol. acetonitrile) 增加溶解度，减小EOF 表面活性剂(SDS) 调节EOF，增溶疏水性溶质 络合缓冲溶液(Borate) 分离糖类和儿茶酚类 季胺盐 (Diaminopropane) 形成离子时，使EOF 反向。 * 迁移时间的重现性 HPCE中，两次分析之间的迁移时间和迁移率的重现性一般可以好于 0.5% RSD。这个值决定于毛细管壁、缓冲液的组成、pH 值和粘度、样品的性质和仪器的质量。 通过适当更换缓冲液或者使用内标法可以大大提高相对迁移时间的重