脱氧核酶要点.pptVIP

第六部分 核酶/脱氧核酶的应用 1、在基础研究领域中的应用 2、在医学领域的应用 3、在农业等其他领域的应用 1、在基础研究领域中的应用 生命的起源？ RNA vs 蛋白质 ? 新的观点：生命从RNA开始 体内选择技术的应用已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。 2、在医学领域的应用 基因治疗的概念出现在二十几年前，现在已经在临床上得到了实际应用。基因治疗最早的临床研究是1990年Blaese 等进行的对腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的治疗，随后在对遗传病、病毒侵染、肿瘤等疾病的治疗中得到广泛的应用。中国也是开展基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等开展了血友病B基因治疗的临床实验，并取得比较理想的效果。 基因治疗的主要策略可以分为: (1) 向体内导入外源基因取代体内 的有缺陷的基因发挥作用； (2) 对致病基因进行抑制。 其中:第二种方法是用反义核酸或核酶通过干涉致基因的转录或翻译而清除其表达产物。 对医疗应用来说最主要的还是那些具有切割特定RNA顺序，从而可以在体内抑制某些有害基因的核酶 。 利用核酶或脱氧核酶抑制有害基因的基本原理 核酶/脱氧核酶作为基因治疗药物的优点： 1、通过识别特定位点而抑制目标基因的表 达，抑制效率高，专一性强. 2、免疫源性低，很少引起免疫反应. 3、针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运. 3 、在农业等其他领域的研究 防治动、植物病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等。 核酶技术面临的问题 1、核酶催化切割反应的可逆性问题 2 、催化效率低，如何提高催化效率 3 、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入 靶细胞 4 、使核酶在细胞内有调控地高效表达 5 、增强核酶在细胞内的稳定性 6 、对宿主的损伤问题有待进一步考察 I类内含子核酶可以用来修复体内的有害突变基因，为修复型基因治疗开辟了一个很有发展前景的途径。 药用核酶应用情况 一,二期临床 人免疫缺陷病毒I City of Hope 临床前期 神经胶质瘤 University of Pittsburgh 临床前期 丙肝病毒 Tokyo University 临床前期 血管生成因子 一,二期临床 人免疫缺陷病毒I Ribozyme Pharmaceuticals Inc. 临床前期 丙肝病毒 Osaka University 临床前期 乙肝病毒, 丙肝病毒 Innovir 临床前期 乙肝病毒, 丙肝病毒 一,二期临床 人免疫缺陷病毒I Gene Shears 一,二期临床 人免疫缺陷病毒I Columbia University 临床前期 B细胞白血病-淋巴瘤 American Cyanamid 临床前期 Anti-ras ribozymes Alza 研究阶段 核酶的作用对象 公司 脱氧核酶抑制有害基因表达的研究情况 增殖下降为75% SuperFect 3’-3’ 翻转 9/9 SMC NGFI-A 减少了85% Huntingtin 蛋白 Lipofectamine 3’-3’ 翻转 8/8 HEK-293 亨廷顿氏遗传病基因huntingtin 抑制77-81% 病毒组装 Lipofectamine 无 7/7 U87 人免疫缺陷病毒I env 50%融合 Lipofectin 无 7/7 HeLa CCR5 50%抑制 Lipofectin 无 7/7 HeLa 人免疫缺陷病毒I 抑制53-80%蛋白表达 Cytofectin Cytofectin 硫代磷酸基2-碱基帽 12/6 CD34+CML- 骨髓细胞 BCR-ABL 抑制40%蛋白表达，50%细胞增殖 Cytofectin 硫代磷酸基2-碱基帽 12/6 K562 BCR-ABL 抑制了99%萤光素酶表达 Lipofectin 2’ 氧甲基帽 8/8-15/15 HeLa (transient) BCR-ABL-萤光素酶 出现细胞凋亡 Lipofectin 2’ 氧甲基帽 8/8-15/15 BV173 酪氨酸激酶癌基因BCR-ABL 抑制80%细胞的增殖 DOTAP 3’-3’ 翻转 7/7-9/9 SMC 癌基因 c-myc 抑制了60% 的E6 RNA DOTAP 3’-3’ 翻转 8/8 3T3细胞系