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第三章 细胞分离技术 第一节、细胞分离 第二节、细胞破碎 第三节、胞内产物的溶解及复性 部分微生物胞内酶 胞内重组药物 分离胞内产物与胞外产物的差别是什么？ 为回收和提纯胞内产品, 必须先将它们从胞内释放到胞外, 然后进行分离纯化。 可以采用分泌性宿主使胞内产物直接分泌到胞外; 也可用破碎细胞的方法使其释放出来。 细胞与液体物质的分离又称为固液分离，固液分离方法包括过滤与离心沉降。 二、离心沉降 沉降法：指固体颗粒在外力作用下与液体物质做相对运动最终实现固液分离的技术。 沉降法根据作用外力的不同，可分为重力沉降和离心沉降。 离心沉降是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提取条件。 1) 差速离心法 离心分离法根据其操作方式的不同，又可分为差速离心和密度梯度离心。 离心过滤机可分离固体密度大于或小于液体密度的悬浮液。 可分为: 连续式离心机和间歇式离心机。 第二节 细胞破碎 细胞破碎： 指选用物理，化学，酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。 一、细胞壁结构 细胞壁化学组成非常复杂, 取决于 微生物类型 细胞的年龄 细胞的生长生理学 多糖，脂质，蛋白质在三维结构上的排列方式 细胞壁的结构 二、细胞破碎率 破碎率： 被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。 1）直接记数法 2）间接记数法 1）直接记数法 平板计数技术 需时长；只有活细胞才能计数；会产生误差 血球细胞器上用显微镜计数 快速而简单，但细胞小计数困难 2）间接记数法 在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。 将破碎后的细胞悬液离心去掉固体（完整细胞和碎片），然后对上清液进行含量或活性分析。 酶活性是破碎程度的很好指示参数。 三、细胞破碎的方法 1）珠磨法（图3-6） 作用机理： 微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混匀，珠子之间及珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。 影响因素： ①转盘转速：破碎比速度与转盘速度成正比。 ②细胞浓度：最佳浓度应由实验确定。浓度大，产生的热量大，但单位细胞重量所消耗的功率小。 ③珠粒大小：在一定范围内，磨珠越小，破碎速度越快，但也不能过小。 ④温度：将温度控制在5～40℃对破碎物影响较小。 ⑤流量：流量大，加工单位质量细胞消耗的能量减小，但细胞的破碎程度和蛋白质的释放量会降低。 温控与能耗 珠磨机是采用夹套冷却的方式实现温度控制的，一般情况下能将温度控制在要求的范围内； 珠磨机的能耗与细胞破碎率成正比； 高的破碎率会提高分离的成本。 2) 高压匀浆法（图3-8） 作用机理 从高压室压出的细胞悬浮液，经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的悬液又射击到静止的碰撞环上，被迫改变方向从出口管流出。 温控与能耗 活性物质在破碎过程中的失活问题。 蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起。如果能将温度控制在35oC以下，酶失活的损失可以忽略。提高压力有利于细胞破碎，但需增加能耗。 机械破碎的能耗主要包括提供动力消耗的能量及低温操作消耗的能量。 3) 超声波法 作用机理 声频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入可以引起空化现象，使气泡形成、胀大和破碎的现象。 此法多适用于微生物材料、细胞培养材料的破碎； 因超声波处理时产热较多，故应用此法时，需要采取降温措施； 另外，某些核酸及酶对超声波敏感，慎用此法。 超声波破碎过程效率的影响因素： ①声频 ②声能 ③处理时间 ④细胞浓度 ⑤菌种类型 四) 化学渗透法 用化学药品改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含 物有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。 五) 酶溶法 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。 溶菌酶、?-1，3-葡聚糖酶、 ?-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶等。 作用机理 溶酶具有高度专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。 酶溶法的优点： ①产品释放的选择性高 ②抽提的速率和收率高 ③产品的破坏最少 ④对pH和温度等外界条件要求低 ⑤不残留细胞碎片 六) 物理法 ①渗透压冲击法 ②反复冻融法 多用于动物细胞。 将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 ③低温玻璃化法 指从超微结构上损伤细胞，使细胞壁、细胞膜等成分遭受破坏。 各种破碎方法