常见化学发光技术教案.ppt

底物AMPPD 在碱性磷酸酶(ALP) 作用下, 磷酸酯基发生水解而脱去 一个磷酸基, 得到一个中等稳定的中间体AMPD (半寿期为2～ 30min) 此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和 一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子, 当其回到基态 时产生470nm 的光, 可持续几十分钟。 ALP-AMPPD发光体系具有非常高的灵敏度，对标记物ALP 的检测限达10-21 mol，是最灵敏的免疫测定方法之一。 对AMPPD加以改进，获得具有更好反应动力学和更高灵敏 度的新一代产物： CSPD、CDP-Star 这些体系已广泛用于各种基因、病原体DNA的鉴定。 所用底物1，2－二氧环己烷衍生物, 是一类很有前途的 发光底物, 用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中 包含起稳定作用的基团——金刚烷基。 其分子中发光基团为：芳香基团和酶作用的基团。 在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。 美国DPC 公司的Immulite 全自动酶放大发光免疫分析 仪, 以碱性磷酸酶为标记物, 以金刚烷作发光底物, 测定灵 敏度相当于10-21mol/mL的酶, 采用聚苯乙烯珠作载体,其检测 水平已能达到10-12g/mL。 （三） 微粒子化学发光免疫分析（MCLIA） 应用碱性磷酸酶（ALP）标记抗原或抗体，以磁性微粒为 固相载体，用AMPPD （Dioxetanes）作为化学发光剂。 这种化学发光剂发光稳定、持续时间长，因此比闪烁发光 容易控制。 代表系统有：Beckman公司的ACCESS。 （四） 电化学发光免疫分析（ECLIA） 1、采用电化学发光技术、生物素放大技术，以磁性微 粒为固相载体； 2、用三联吡啶钌标记抗原或抗体， 用三丙胺为电子供 体，在电极表面失去电子而被氧化，氧化的三丙胺失去一个 H+ 而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价 钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物； 3、这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出 光子的分析技术。 此法较为敏感而稳定，为测试技术中一项新技术。 以Roche 公司生产的ELECSYS 为代表。 由于采用链霉亲合素-生物素技术和电化学发光技术， 灵敏度达到甚至超过放射免疫分析的水平 。 ECLIA的突出优点是： ①标记分子小，可实现多标记，标记物非常稳定； ②发光时间长，灵敏度高； ③光信号线性好，动力学范围宽，超过6个数量级； ④可重复测量，重现性好； ⑤可实现多元检测和均相免疫分析； ⑥快速，完成一个样品的分析通常只需18 min； ⑦可实现全自动化。 目前已广泛应用于抗原、半抗原及抗体的免疫检测。 （五） 增强化学发光（ECL） 1、将生物素化的（Biotinylated）第一抗体通过亲合素 （Streptavidin）包被于反应杯内表面上； 2、当待测物与之结合后，再加入用辣根过氧化物酶 （HRP）标记的第二抗体； 3、加入一种特殊的催化剂与发光醇（Luminol）及其他 试剂后，可使辣根过氧化物酶氧化发光醇的反应速度大大提 高。 此技术见于： 美国Johnson Johnson的VITROS Eci的全自动免疫分析 仪。 五、 流式细胞分析 流式细胞分析是综合激光技术、计算机技术、显微荧光 光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学多门学 科的科学技术。 流式细胞仪的原理 1、采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率； 2、利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性； 3、用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据分析，保证检测速度与统计分析的精确性。 代表的分析仪有： 贝克曼的EPICS流式细胞仪 BD的 FACSCalibur流式细胞仪 六 、生物芯片 生物芯片（Biochip）又称微阵列（Microarray），是一种通过微加工技术和微电子技术，在固相载体芯片表面构建的