多聚酶链式反应——PCR扩增DNA好解析：.ppt

【易误警示】　(1)DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。 (2)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。 (3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。 知能过关演练 本部分内容讲解结束 点此进入课件目录 按ESC键退出全屏播放 谢谢使用 优化方案系列丛书 专题5　DNA和蛋白质技术 基础自主梳理 核心要点突破 知能过关演练 课题2　 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课标领航 1．尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作。 2．理解PCR的原理和反应过程。 3．讨论PCR的应用。 【重点】　PCR的原理和反应过程。 【难点】　PCR技术的操作过程。 情境导引 PCR诊断技术又叫多聚酶,链式反应技术，它采用分子技术,模拟核酸在体内的复制，从而判,定疾病病原体的种类，所以从本,质上来说，这是一种分子诊断方法。 核心要点突破 知能过关演练 课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段 基础自主梳理 基础自主梳理 一、PCR扩增的原理及条件 1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。 2．原理 (1)DNA的热变性：在80～100 ℃的温度范围内，DNA_________结构解体，双链分开，这个过程称为_____。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 多聚酶链式反应 DNA 双螺旋 变性 (2)子链的合成：①需要______；②合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 3．条件 (1)______模板。 (2)分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。 (3)A、T、G、C四种______________。 (4)耐热的DNA聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶。 (5)需要稳定的_____和能严格控制_____的温控设备. 引物 DNA 脱氧核苷酸 pH 温度 思考感悟? 1．什么是引物？若要克隆DNA，应加入几种特定的引物？ 【提示】　所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。DNA是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。 二、PCR反应过程 PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为____、复性和延伸三步。 1．变性：当温度上升到______以上时，双链DNA解聚为单链。 2．复性：温度下降到_______左右，两种引物通过________________与两条单链DNA结合。 3．延伸：温度上升到_____左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 变性 90 ℃ 50 ℃ 碱基互补配对 72 ℃ DNA聚合酶 思考感悟? 2．PCR循环过程中，变性温度设置95 ℃，时间设置30 s的原因是什么？ 【提示】　变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。 三、实验操作 1．实验用具 (1)PCR仪：该仪器能自动调控_____，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个___________代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。 (2)微量离心管：总容积为0.5 mL，实际上是进行离心的场所。 (3)微量移液器：用于吸取转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。 温度 恒温水浴锅 2．操作步骤 准备→____→混合→_____→反应。 四、操作提示 1．为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行__________。 2．所用的_________和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。 五、DNA含量的测定 1．原理：利用DNA在260 nm的紫外线波段的______曲线来测定相应含量。 2．计算公式：DNA含量(μg)＝50×(260 nm的读数)×_____________。 移液 离心 高压灭菌 缓冲液 吸收 稀释倍数 核心要点突破 PCR原理 1．PCR扩增方向：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 2．PCR原理——DNA的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合