生化分析翻译作业.docVIP

2.1.1吸光光度法(280nm) 使用注意事项 吸光光度法操作起来十分快捷方便，因为并不需要添加额外的试剂或进行预处理。没有蛋白质标准需要准备。吸光光度法不消耗蛋白质，吸光度与蛋白质的浓度呈线性关系。由于不同的蛋白质和核酸俱有各自不同的吸收特性，因此对未知成分的物质或蛋白质的混合物，吸光光度法可能有较大误差。溶液中任何对紫外光有吸收的非蛋白成分都会干扰测定。细胞和组织样品中往往含有会干涉测定的不溶性或有色成分。吸光光度法最常见的用途是监视层析柱分数，或是应用在需要快速估测、蛋白质浓度的误差可以忽略不计的场合。吸光度法在操作时，常用牛血清白蛋白或其他纯蛋白质溶液进行标定。 原理 溶液中的蛋白质在280和200nm处对紫外光有最大吸收值。含芳环的氨基酸是造成280nm处吸收峰的主要原因，200nm处的吸收峰由肽键引起。二级、三级、四级结构都会影响吸收，所以pH、离子强度等，均可对吸收光谱产生影响。 仪器设备 除了标准溶液以外，还需要紫外分光光度计和石英比色皿。 分析 未知的蛋白质或蛋白质的混合物。使用下面的公式来粗略估算蛋白的浓度。 大多数分光计的光路长度为1cm。 浓度（mg/ml）=280nm处吸光度除以光路长度（cm.） 已知吸光系数的纯蛋白质。 对于1cm的光路，使用下列公式。 浓度的单位是采用mg/ml、%或体积摩尔浓度，取决于操作所使用的系数。 浓度=280nm处的吸光度