基因工程-第一章核酸的制备教程分析.pptVIP

已知序列 未知序列 未知序列 连接酶 2）不对称PCR (asymmetric PCR) 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一 般是0.01∶0.5μM。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物 低浓度引物 3）RT－PCR: 方法：以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应, 用途： 测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变, 克隆mRNA的5’和3’末端序列, 以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 4）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称，其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 5）实时定量PCR技术 实时定量PCR（也称TaqMan PCR, FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术， 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的。 利用设计好的引物，将不同基因，或基因的不同区域连接起来。 6）融合PCR技术 引物（Primer） 基因A 基因B 4.4.2 PCR技术应用 研究 基因克隆，分子检测，DNA测序，分析突变，分子进化 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 法医 犯罪现场标本分析 医学 临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控 其他…… 第四节 DNA序列测定（DNA Sequencing） 一、DNA序列测定： 通过各种方法得知DNA一级结构各种碱基的排列顺序，是详细分析基因结构和功能的基础。 二、双脱氧链终止法： 利用DNA聚合酶合成单链DNA模板互补链的性质进行测序。在dNTP中掺入一定比例的ddNTP，使延伸随机终止，并通过毛细管电泳分离各DNA片段。 ddNTP 经PAGE分离，描出来的DNA的片段 * * * 离子交换柱层析纯化DNA 2. DNA的浓缩： 2.1 乙醇（Ethanol）沉淀法； 2.2 正丁醇（ butyl alcohol ）抽提法； 2.3聚乙二醇（PEG6000）浓缩法； 第三节 人工合成核酸片段 二、核酸的酶法合成 PCR反应（Polymerase Chain Reaction, 聚合酶链式反应）： 模仿细胞内发生的DNA复制过程，在体外有酶催化合成特异性DNA片段。 PCR技术简史 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… PCR技术简史 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 1. PCR的基本原理(Mechanism of PCR ) 类似于DNA的体内复制。 其原理是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以几何级数倍增。 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 （3）PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C PCR反应 标准的PCR反应条件： 10X缓冲液（Buffer）10 μL 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物（Primer） 各10～100pmol 模板DNA （Template） 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 0.5 ～ 2.5U Mg2+ 　　　　　 1.5mmol/L PCR反应 70-75℃ 90-94℃ 37-60℃ PCR循环 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR反应 适温延伸